骨髓间充质干细胞促进大鼠80%肝切除后残肝再生及修复作用的研究*

龚慧宾 沈中阳 宋红丽 郑卫萍 董 冲 宋晓静 张 静

肝移植目前已被公认为是治疗各种终末期肝病的有效手段，但供体的短缺影响了肝移植的进程，活体肝移植为终末期肝病患者带来了希望，尤其是成人右半肝活体肝移植扩大了供肝体积，从而减少了因供肝体积不足带来的问题[1]。然而供体残肝体积不足导致的肝功能衰竭的风险很大，其中肝细胞损伤及再生延迟是影响活体肝移植疗效的重要因素之一。骨髓间充质干细胞（bone marrow mes⁃enchymal stem cells，BMSCs）具有向肝细胞分化的潜能和自我更新能力，是目前细胞治疗组织工程领域的热点[2-3]。本实验旨在研究BMSCs是否能促进扩大肝叶切除后残肝的肝细胞再生及修复。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 提取BMSCs的大鼠为：4～5周龄SPF级Wistar大鼠，体质量100～120 g。动物模型用大鼠为：6～8周龄SPF级Wistar大鼠，体质量200～220 g。均购自军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要试剂及仪器 二甲基亚砜和胰蛋白酶（Sigma公司），培养液为DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国Gibco公司），Percoll淋巴细胞分离液（Amersham Bioscience公司）。小鼠抗大鼠的CD34-PE、CD44-PE、CD90-FIT、CD29-FITC抗体和细胞周期试剂盒（BD公司）。增殖细胞核抗原（prolifera⁃tion cell nuclear antigens，PCNA）免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），Beckman全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs的提取、纯化及鉴定 （1）BMSCs的提取和纯化：5%水合氯醛腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡3 min，无菌环境下取胫骨和股骨，原代培养用DMEM/F12培养液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞悬液以1∶1的比率覆盖于密度为1 073 g/L的Percoll淋巴细胞分离液上层，离心收集中间白膜层细胞，PBS液洗2遍，用含10%胎牛血清DMEM/F12重悬。以1×108/L细胞密度接种于25 cm2培养瓶中，48 h首次换液，待细胞接近融合80%时加入0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2传代。通过贴壁培养方法，每次换液弃除悬浮细胞，从而使BMSCs得到纯化。（2）BMSCs的鉴定：取生长良好的第3代细胞，消化、计数，使细胞浓度为5×109/L，分别加入5 μL的抗体CD34、CD44、CD90及CD29，同时用PBS作为阴性对照，冰浴30 min后，行流式细胞仪检测。表达CD90、CD29及CD44而不表达CD34者为BMSCs。

1.2.2 80%肝切除大鼠模型的建立 取36只雄性Wistar大鼠，半开放式乙醚吸入麻醉，上腹横切口入腹，离断镰状韧带、左三角韧带及肝胃韧带，采用中线3-0线双线结扎法分别结扎左叶、中叶以及尾状叶，以减少术中出血。留右叶和三角叶，即为80%肝切除手术[4]，术中注意止血彻底。

1.2.3 细胞移植 根据预实验的大鼠存活率选择实验组和对照组的例数，以确保术后存活各个时间段的大鼠数量一致，将80%肝切除模型大鼠采用随机数字表法分为实验组（n=16）和对照组（n=20），实验组于术后即刻取预先消化的BMSCs，细胞计数，调整细胞浓度为2×108/L，用肝素化的1 mL注射器取1 mL细胞悬液经门静脉注射，对照组给予等量无菌生理盐水，分别于术后1、3及7 d各处死5只，留取血液和肝组织。

1.2.4 肝细胞增殖方法及结果判定 （1）流式细胞仪检测：取部分新鲜肝脏组织研磨，透过200目滤网制备单细胞悬液，用细胞周期试剂盒按照说明书进行染色、上机，采用流式细胞技术检测细胞周期，比较S期细胞所占比例。（2）免疫组化法：观察PCNA的表达水平，计算PCNA指数具体方法为每张切片随机读取10个视野，光镜400倍下计数PCNA阳性细胞数[5]，PCNA指数=PCNA阳性细胞数/全部肝细胞数（每个视野）×100%。

1.2.5 肝细胞修复相关检测 （1）生化检测：分别检测血清中的谷氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。（2）组织HE染色：HE染色观察肝脏组织学变化。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，全部数据处理均以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察及表型鉴定 （1）形态学观察：刚接种的细胞镜下呈大小较均一的圆形，胞膜清晰，胞体透亮。接种48 h后可见细胞贴壁，贴壁生长的BMSCs散在分布，开始呈圆形，部分细胞有伪足伸展，呈椭圆形、纺锤形、梭形或多角形。8～10 d后80%以上细胞融合。传代细胞生长迅速，约6 d细胞融合，见图1。（2）表型鉴定：75.36%的细胞表达CD29、CD44及CD90，不表达CD34，为BMSCs，见图2。

图2 BMSCs的鉴定

2.2 生存率比较 实验组80%肝切除术后生存15只，1只死于感染；对照组生存15只，5只均在术后24 h内死亡，死因主要是感染（1只）、弥漫性肠系膜下出血（1只）、腹水（2只）和胆汁淤积（1只）。

2.3 肝组织HE染色 实验组术后1、3和7 d时肝脏组织显示肝窦轻度扩张，较少的炎性细胞浸润，少见坏死，坏死程度明显轻于对照组，术后3 d差异尤为明显；对照组术后3 d，肝脏组织HE染色可见肝窦扩张明显，大量炎性细胞浸润，大量片状坏死，细胞气球样变，见图3。

图3 大鼠80%肝切除术后3 d时肝脏病理改变（HE×400）

2.4 BMSCs对肝功能的影响 大鼠80%肝切除术后，实验组和对照组ALT、AST水平于术后1 d达最高峰，以后逐渐下降，但实验组下降水平明显高于对照组。实验组术后1、3和7 d时ALT、AST水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

2.5 BMSCs对残肝细胞周期的影响 实验组术后7 d时G0/G1期和术后3 d时G2/M期细胞所占比例均低于对照组，术后1、3和7 d时S期细胞所占比例高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

2.6 BMSCs对细胞增殖的影响 术后3 d实验组肝细胞PCNA水平达高峰，实验组术后不同时间PCNA表达水平高于对照组（均P＜0.01），见图4、表3。

表12 组术后不同时间ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

表12 组术后不同时间ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，表2、3同

组别 ALT术后1 d 术后3 d 术后7 d对照组实验组t 2 270.05±209.37 1 248.07±149.13 4.346＊＊560.90±26.25 157.17±15.56 3.086＊110.17±19.97 41.25±8.27 4.632＊＊组别对照组实验组t AST术后1 d 术后3 d 术后7 d 1 670.67±230.14 747.35±140.14 3.841＊＊633.57±80.07 279.50±29.95 3.812＊＊281.12±39.62 103.87±16.67 3.943＊＊

表2 2组术后不同时间细胞周期的变化（n=5，%，±s）

表2 2组术后不同时间细胞周期的变化（n=5，%，±s）

组别 G0/G1期术后1 d 术后3 d 术后7 d对照组实验组t 64.45±15.13 56.72±10.76 1.040 51.83±10.76 63.45±5.82 0.836 68.36±25.09 56.93±7.66 3.011＊组别对照组实验组t G2/M期术后1 d 术后3 d 术后7 d 28.29±14.32 33.33±9.72 0.554 39.66±3.81 19.46±3.78 7.720＊＊28.20±17.00 33.33±7.76 0.518组别对照组实验组t S期术后1 d 术后3 d 术后7 d 3.45±1.87 9.75±0.10 3.680＊＊7.24±0.83 11.22±1.20 5.116＊＊8.51±0.42 16.47±3.64 5.429＊＊

表3 2组术后不同时间残肝组织PCNA水平变化（n=5，%，±s）

表3 2组术后不同时间残肝组织PCNA水平变化（n=5，%，±s）

组别 术后1 d 术后3 d 术后7 d实验组对照组t 24.62±2.92 13.42±0.55 7.515＊＊56.65±7.48 30.25±2.58 6.665＊＊7.42±1.60 3.55±0.75 6.468＊＊

3 讨论

小肝综合征是一种发生在扩大肝切除或减体积肝脏移植后的临床综合征。Heaton[6]对因部分肝脏移植或由于肿瘤行扩大肝叶切除术后小肝综合征定义为：由于植入的肝脏体积或扩大肝叶切除后残肝体积过小而导致功能上不能满足受体的需求，从而出现的一种临床综合征。其临床表现为：术后持续性胆汁淤积、凝血机制紊乱、门静脉高压、腹水、持续性肝脏功能异常、脓毒血症、胃肠出血等并发症。组织学特征为：肝细胞呈气球样变、脂肪变性，胆汁瘀积形成胆栓，缺血性斑片状坏死区和增生区并存。部分肝脏移植物或扩大肝叶切除后残肝可以通过肝细胞再生的方式满足所需要的体积，但是在肝脏再生之前，残肝体积＜35%时术后发生肝功能衰竭的可能性很大。在临床上，出于对供体安全的考虑，多数供者只能提供有限体积移植肝脏，即所谓的小体积移植物，而对于肝脏肿瘤的患者，大多数已经存在肝硬化的基础病变，同样不能耐受扩大肝叶的切除手术，这种矛盾是导致小肝综合征发生的重要原因[7]。本实验构建80%肝切除大鼠模型，通过门静脉注射BMSCs，发现BMSCs能显著促进肝再生及修复，其机制可能与BMSCs与肝再生关系密切有关。BMSCs是一种比较原始的骨髓基质细胞，具有能够自我更新和多向分化的潜能[8]，在适宜的条件下可被诱导分化成各种组织细胞，包括肝细胞[9]。BMSCs具有基质细胞的特性，能够分泌各种细胞因子，促进肝再生[10-11]。国内学者研究发现，经门静脉途径注射BMSCs能显著改善急性肝损伤小鼠肝功能[12]。

大鼠70%肝切除术后7 d残肝再生可恢复到正常大小，出现小肝综合征的比率低[13]，切除90%为极限体积，术后平均生存时间仅12 h[14]，无法观察BM⁃SCs对小体积残肝的修复和再生作用，故本实验选择80%肝切除模型。

本研究发现BMSCs作用于80%肝切除大鼠后，实验组各时间段血ALT、AST水平明显低于对照组，提示BMSCs能促进肝功能恢复；细胞增殖周期中S期细胞比例高于对照组，说明肝细胞再生快于对照组。实验组肝细胞PCNA水平于术后3 d达高峰，随后逐减低。实验组1、3和7 d时PCNA表达水平均明显增高，提示BMSCs能促进肝细胞增殖。总之，BMSCs可以促进大鼠80%肝切除肝再生及修复，提高生存率。

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