复方甘草酸苷、地塞米松对毛乳头细胞活性影响的研究*

张国强 程 毅 李 玲 高顺强

近年来，复方甘草酸苷被广泛用于皮肤病和肝病的治疗，临床研究显示复方甘草酸苷对斑秃治疗有效[1-2]。糖皮质激素应用于斑秃治疗已有60余年，是目前治疗斑秃最为常用、可靠及有效的方法之一，2种药物的主要机制可能与抗炎及免疫抑制有关。本研究旨在观察复方甘草酸苷和地塞米松对人毛乳头细胞生长的影响，为临床筛选刺激毛囊及毛发生长的药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）标本来源：正常人头皮取自我院2009—2010年神经外科手术患者，年龄20～40岁，无系统性疾病，头皮标本离体6 h以内。（2）主要试剂和仪器：分离酶、胶原酶D、L-谷氨酰胺、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司，DMEM购自美国Hyclone公司，鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购自美国Neomarker公司，胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司，复方甘草酸苷购自日本美能发源制药公司，地塞米松购自郑州卓峰制药有限公司。倒置相差显微镜购自日本Nikon公司，酶标仪购自郑州博塞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 毛乳头细胞的分离培养 人毛乳头细胞采用两步酶消化分离法[3],分离得到纯化的人毛乳头细胞加含10%胎牛血清的DMED培养基混匀后，以每培养瓶30～50个毛乳头的密度接种。待毛乳头贴壁后换液，去除未贴壁的单个细胞及杂质。分离出的毛乳头3 d后90%贴壁，贴壁1 d后可观察到细胞迁出呈放射状生长，2～3周后细胞大部分生长融合。

1.2.2 毛乳头细胞的鉴定 取第2代毛乳头细胞，0.25%胰酶消化、传代至放有盖玻片的6孔板，5%CO2温箱37℃孵育24 h，收取盖玻片，4%多聚甲醛固定15 min，4℃过夜。用α-平滑肌肌动蛋白单抗作为一抗对毛乳头细胞进行染色，按S-P法介绍的步骤进行。以PBS代替一抗作为阴性对照，胞浆出现黄色颗粒为(+)，棕色颗粒为(++)，褐色颗粒为(+++)。

1.2.3 噻唑蓝（MTT）法检测药物对人毛乳头细胞增殖活性的影响 取对数生长期的第3代人毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以105的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后吸取培养基，设空白对照组和实验组，实验组又分为复发甘草酸苷组和地塞米松组，实验组每孔加入含不同浓度药物(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100 mg/L)的10%胎牛血清的DMEM培养基100 μL，每个浓度6个复孔，空白对照组只加含10%胎牛血清的DMEM培养基。继续培养72 h后，每孔加入5 mg/L的MTT 10 μL，置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养4 h后弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，避光条件下充分震荡，酶标仪于波长492 nm处测定各孔吸光度值(A492)。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，多个样本两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 α-平滑肌肌动蛋白在人毛乳头细胞中为阳性表达，呈细丝状沿细胞长轴分布，见图1。

图1 人毛乳头细胞α-平滑肌肌动蛋白表达（免疫组化×200）

2.2 药物干预对人毛乳头细胞增殖的影响 （1）复方甘草酸苷干预结果：处于对数生长期的第3代毛乳头细胞加入不同浓度的复方甘草酸苷培养72 h后，普通光学显微镜下观察细胞形态未见明显差异。MTT结果显示各浓度组间比较，差异有统计学意义（F=3.627，P＜0.05），与对照组相比，10、20、50 mg/L均能明显促进细胞增殖（P分别为0.025、0.002、0.003）。在0.5～20 mg/L浓度范围内，促增殖作用逐渐增强，浓度再增加，其促增殖作用反而减弱，见图2。（2）地塞米松干预结果：处于对数生长期的第3代毛乳头细胞加入不同浓度的地塞米松培养72 h后，普通光学显微镜下观察细胞形态未见明显差异。MTT结果显示各浓度组间比较，差异有统计学意义（F=3.045，P＜0.05），与对照组相比，1、2.5 mg/L均能明显促进细胞增殖（P分别为0.004和0.001）。在0.5～2.5 mg/L浓度内，促增殖作用逐渐增强，浓度再增加，其促增殖作用有所减弱，见图3。在倒置显微镜下观察经2种药物处理的细胞，复方甘草酸苷组较地塞米松组细胞生长状态好，胞浆更为丰富。

图2 不同浓度复方甘草酸苷对人毛乳头细胞增殖的影响

图3 不同浓度地塞米松对人毛乳头细胞增殖的影响

3 讨论

甘草是传统中药养发生发产品中使用频率较高的药物和添加成分，复方甘草酸苷的主要成分为甘草酸苷，即β-甘草酸，并复方了甘氨酸及半胱氨酸（片剂为蛋氨酸），具有多种药理作用。因其具有抗超敏反应、抗炎症的作用，在皮肤科领域常被用于治疗多种过敏性皮肤疾病，近来多项临床研究显示其对斑秃治疗有效[1-2]，且体外毛囊培养证明甘草提取物对毛发生长有促进作用[4]。糖皮质激素给药方法有外用、局部注射和系统给药，其作用机制主要与抗炎及免疫抑制有关，其中局部注射是较为安全有效的方法之一，该法在国外通常作为局限性斑秃治疗的首选[5]，并且在美国皮肤病学委员会指南报告中被列为斑秃的首选治疗方案[6]。以往对这2种药物作用于斑秃作用机制的研究大都集中在其抗炎、免疫抑制方面。Thornton等[7]发现糖皮质激素作用于毛乳头细胞的机制与雌激素及其β受体有关。有文献报道，斑秃患者皮损部位的毛囊总数减少，生长期毛囊则明显减少甚至消失，多数毛囊为退行期、休止期改变，毛乳头缩小、消失[8]。本研究表明复方甘草酸苷和地塞米松分别能在一定浓度范围内刺激毛乳头细胞增殖。2种药物在抗炎、免疫调节的同时还可能调节了毛乳头细胞的活性，进而通过多种细胞因子、生长因子如成纤维细胞生长因子7等，调节毛囊上皮细胞，并促进毛母质细胞增殖分化，最终诱导毛发生长[9]，提示寻找能够增强毛乳头细胞活性的药物将是治疗各类脱发性疾病的又一切入点。在倒置显微镜下可见复方甘草酸苷处理的细胞较地塞米松生长状态好，胞浆更为丰富。推测在治疗脱发性疾病方面，复方甘草酸苷可能较传统的糖皮质激素更有优势。

[1]周静，杨勤萍，徐峰，等.复方甘草酸苷治疗斑秃10例临床疗效观察[J].中国皮肤性病学杂志，2008，22(7):446-447.

[2]罗洋，杜华，鞠英，等.复方甘草酸苷治疗斑秃的疗效观察[J].中国麻风皮肤病杂志，2007,23（12）：1116.

[3]Wu JJ,Liu RQ,Lu YG,et al.Enzyme digestion to isolate and cul⁃ture human scalp dermal papilla cells:a more efficient method[J]. Arch Dermatol Res,2005,297(2):60-67.

[4]范卫新，朱文元.55种中药对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究[J].临床皮肤科杂志，2001，30(2):81-84.

[5]Priee VH.Treatment of hair loss[J].N Engl Med，1999，341(13): 964-973.

[6]Drake LA，Ceilley RI，Cornllison RL.Guidelines of care for alopeeia areata[J].Am Acad Dermatol，1992，26(2 Pt 1):247-250.

[7]Thornton MJ,Nelson LD,Taylor AH,et al.The modulation of aroma⁃tase and estrogen receptor alpha in cultured human dermal papilla cells by dexamethasone:a novel mechanism for selective action of estrogen via estrogen receptor beta[J]?J Invest Dermatol,2006，126 (9):2010-2018.

[8] 陈丽芳，史维平，郝树媛，等.23例斑秃患者皮损部位病理改变分析[J].中华皮肤科杂志，2003，36(9):523.

[9]Kawano M，Komi-Kuramochi A，Asada M，et al.Comprehensive analysis of FGF and FGFR expression in skin:FGF18 is highly ex⁃pressed in hair follicles and capable of inducing anagen from telo⁃gen stage hair follicles[J].J Invest Dermatol，2005，124(5):877-885.