重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达*

付 晓 朱梦瑜 高星杰 钱宝鑫 王保亚 赵 虹 葛 林 杨 洁

人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuclease）蛋白，又称为p100蛋白、SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1），首次作为EB病毒细胞核抗原2（Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录调控激活因子被发现[1]。Callebaut等[2]运用疏水簇结构分析（hydrophobic cluster analysis，HCA）发现人类Tudor-SN蛋白由N端4个重复葡萄球菌核酸酶样（staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN（1～4）结构域及C端的Tudor-SN 5（TSN）结构域组成。本研究采用能够表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的pERFP-C1质粒载体，构建pER⁃FP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)重组质粒，在真核细胞内表达带红色荧光标签的Tudor-SN蛋白SN（1～4）各功能片段，从而为深入研究Tudor-SN蛋白SN结构域的生物学功能提供便利工具。

1 材料与方法

1.1 材料 真核表达质粒pSG5-Tudor-SN-flag、pERFP-C1-Tudor-SN，大肠杆菌DH5α及HeLa细胞均为本实验室保存。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA连接酶均购自Fer⁃mentas公司，Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司，T/A载体（pTZ57R/T）购自大连Takara生物工程公司，B型小量DNA快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，质粒快速小提试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。倒置荧光显微镜购自日本Olym⁃pus公司，显微数码摄影机购自日本Nikon公司，引物由北京六合通公司合成，基因测序工作由北京天一辉远生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的获取 参照质粒快速小提试剂盒内说明书提取pSG5-Tudor-SN-flag质粒DNA。根据Tudor-SN的SN（1～4）结构域序列设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点的引物序列，见表1。以pSG5-Tudor-SN-flag质粒DNA为模板，PCR扩增SN（1～4）各片段，条件为95℃预变性5 min,95℃30 s,55℃45 s,72℃3 min共33个循环，72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒进行目的片段回收，在T4 DNA连接酶作用下，与T/A载体22℃连接过夜。连接产物转化感受态细菌DH5α，在含有氨苄的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取质粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化各目的片段。

表1 Tudor-SN的SN(1～4)功能片段引物序列

1.2.2 线性pERFP-C1的获取 采用pERFP-C1质粒载体，见图1。以质粒快速小提试剂盒提取pERFP-C1-Tudor-SN质粒DNA，采用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切pERFP-C1-Tudor-SN质粒，完整切下线性pERFP-C1质粒载体，琼脂糖电泳。凝胶回收试剂盒回收得到约4 700 bp线性pERFP-C1。

1.2.3 重组真核表达质粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的构建 在T4 DNA连接酶作用下，将线性pERFP-C1质粒载体与具有相同黏性末端的Tudor-SN各功能片段SN(1～4)进行22℃连接过夜。连接产物转化感受态细菌大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增并提取重组质粒。

图1 pERFP-C1质粒图谱

1.2.4 单、双酶切及基因测序鉴定 用EcoRⅠ和BamHⅠ对重组质粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）进行单、双酶切，并以1.5%的琼脂糖凝胶电泳验证片段的大小。同时，对重组质粒进行基因测序鉴定。

1.2.5 HeLa细胞的转染及荧光显微镜观察 以去内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素重组质粒。HeLa细胞接种至10 mm培养皿中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37℃、5%的CO2培养箱中培养，至细胞80%汇合时，依据产品说明书进行脂质体瞬时转染。转染后48 h，在倒置荧光显微镜下观察pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的表达并以显微数码摄影机拍照。

2 结果

2.1 PCR扩增目的片段 以pSG5-Tudor-SN-flag为模板进行PCR扩增，再以1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果在500 bp左右观察到与目的片段长度相符的荧光条带，见图2。

图2 目的片段SN（1～4）的获取

2.2 线性pERFP-C1质粒载体的获取 采用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切pERFP-C1-Tudor-SN质粒，切下完整的线性pERFP-C1质粒载体，经1%琼脂糖凝胶电泳，在4 700 bp左右出现条带，见图3，纯化回收后用于后续的连接反应。

图3 线性pERFP-C1质粒载体的获取

2.3 重组真核表达质粒pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的鉴定

2.3.1 单、双酶切及测序鉴定 将构建的重组质粒分别进行EcoRⅠ和BamHⅠ的单、双酶切，产生的条带大小与预期相符，见图4，重组质粒基因测序结果正确，证明Tudor-SN-SN（1～4）各功能片段已成功插入到pERFP-C1的多克隆位点上。

图4 pERFP-C1-Tudor-SN-SN（1～4）的单、双酶切鉴定图

2.3.2 荧光显微镜下观察重组质粒的表达 在10 mm培养皿上接种HeLa细胞，脂质体瞬时转染pER⁃FP-C1-Tudor-SN-SN（1～4），培养48 h后，荧光显微镜下可见红色荧光蛋白RFP-Tudor-SN-SN（1～4）的表达，见图5。

3 讨论

本研究所采用的pERFP-C1是将pEGFP-C1载体中编码绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的基因替换为樱桃红色荧光蛋白（cher⁃ry-RFP）基因后得到的一种真核质粒载体，其多克隆位点（multiple cloning site,MCS）位于RFP序列和SV40 polyA之间。插入到MCS的目的基因如果与RFP基因的阅读框一致，就可以与RFP的C末端融合表达，且目的蛋白的生物学活性通常不受影响。重组真核红色荧光质粒转染入细胞后并不干扰细胞的生长，还可根据红色荧光信号来定位示踪目的蛋白，故该质粒可用于活细胞状态下目的基因表达的观察、质粒转染效率的鉴定及蛋白间结合关系的研究等。

图5 荧光显微镜下观察重组质粒的表达（×40）

真核基因表达是一个精细复杂的过程，包括基因转录、pre-mRNA剪接、mRNA翻译等步骤。基因转录和pre-mRNA剪接并非2个独立的的过程，常通过某些特定蛋白的作用而紧密相联[3]。人类Tu⁃dor-SN蛋白就是一种可偶联调控转录和剪接过程的多功能蛋白。研究发现，Tudor-SN蛋白作为一种转录共激活因子，借助其N端重复的SN结构域与c-Myb[4],STAT6[5],STAT5[6]等多种启动子特异转录因子结合，在基因的转录调控中发挥重要作用。本研究将Tudor-SN蛋白的SN（1～4）基因序列成功插入到pERFP-C1质粒中，构建针对SN结构域的红色荧光重组质粒，其可与特定转录因子的绿色荧光重组质粒共同转染入真核细胞，通过共聚焦显微镜技术进行共定位分析，将有助于进一步研究Tudor-SN蛋白不同SN片段在基因转录调控的作用。

葡萄球菌核酸酶又称为耐热核酸酶，是一种Ca2+依赖酶，可水解单/双链DNA和RNA的5-磷酸二酯键，生成3-单核苷酸和多核苷酸，其催化能力主要依赖于其氨基酸序列中的2个活化位点[7]。人类Tudor-SN蛋白的SN结构域虽与葡萄球菌核酸酶相似，却未发现此活化位点，推测其可能没有催化DNA的能力[8]。然而，Tudor-SN蛋白SN结构中的第一个亚结构域（98个氨基酸）却含有可识别多种核苷酸的保守OB折叠结构（oligonucleotide/oligosac⁃charide-binding fold，寡聚核苷/寡聚糖结合折叠）[2]，提示Tudor-SN蛋白的SN结构域虽没有核酸酶的催化位点，但仍有可能与核酸结合。本研究成功进行了Tudor-SN蛋白不同SN结构域的红色荧光标记，有助于深入探讨该多功能蛋白在基因转录调控、核酸代谢及相关疾病发生中的作用。

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