应用近红外荧光淋巴显像诊断正常肢体及淋巴水肿

近红外荧光（near infrared fluorescent，NIRF）显像是荧光探针在特定波长红光激发下，发出NIRF（700～900nm），通过显像系统再现出组织内部荧光分布的显像技术，是近年来的分子影像研究热点之一[1]。该显像具有高时间敏感性、实时性、无辐射性及长期监测可能性等诸多优势，成为体内显像的焦点。迄今为止，已有美国、日本及德国的几个临床研究小组报道了NIRF显像临床研究，其中以淋巴水肿（lymphedema）的诊断及前哨淋巴结活检较为多见[2～5]。

NIRF淋巴显像最先由Unno等[6]于2007年提出，他们对10例健康人及12例下肢继发性淋巴水肿患者进行NIRF显像，初步显示了NIRF淋巴显像的优势。随后，Sevick-Muraca研究小组亦应用NIRF显像进行了健康人NIRF淋巴显像，成功论证了该显像方法的可行性及优越性[3,7,8]。

本研究旨在进一步探索正常肢体与淋巴水肿肢体在淋巴结构及功能上的异同，研究不同程度肢体淋巴水肿患者的显像特点及与疾病病程的关系，制订诊断标准，以论证NIRF淋巴显像的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究对20例正常人及20例诊断为单侧肢体淋巴性水肿患者（上肢水肿10例，下肢水肿10例）进行NIRF淋巴显像，其中男性6例，女性34例；年龄29～67岁，平均年龄44岁。在淋巴水肿患者中，原发性水肿3例，继发性水肿17例（术后13例，外伤后2例，感染性疾病引起2例）。

1.2 仪器设备 所用设备为自行研制的 NIRF学显像仪：激光二极管500mW，激发光785nm/1.9mW/cm2/ 900cm2；785nm全息陷波滤波器（光学强度≥6），830nm通带滤光片（光学强度≥4）；CCD（charge coupled device）相机（28nm 尼康Nikkor镜片）；第三代影像增强器。

1.3 显像剂 本研究采用吲哚青绿（indocyanine green，ICG，Akron Inc.）作为NIRF显像剂。制备方式为：将 ICG冻干粉用生理盐水稀释为 0.25mg/m l的注射液，每支注射器抽取100µl ICG注射液待用。

1.4 注射方法及采集条件 受检者仰卧于受检床上，暴露受检部位。以上肢为受检部位者，将在双手第2、4指璞间，腕部掌面2处，前臂内外两侧等6处皮内注射ICG；而以下肢为观察对象者，将在双足第2、4趾璞间，内踝，小腿内侧外，大腿内侧等6处皮内注射 ICG。每注射点 ICG注射剂量为25µg/100µl，总注射量＜0.4mg/人次，黑色胶布遮盖注射点。注射后15min，患者佩戴激光防护眼镜，行双侧肢体的动态采集，采集顺序通常由肢体远端至肢体近端，采集速度为200ms/帧。

1.5 图像分析 所得20例正常人及20例淋巴水肿患者四肢NIRF图像均应用Image J（NIH）及Matlab（Mathworks）软件进行处理及回顾性分析。其中，淋巴管结构、NIRF分布区域、淋巴回流状态、淋巴推进间隔时间及区域淋巴结为观测要点。

2 结果

2.1 正常淋巴显影 正常人皮内注射 ICG后 15～30m in肢体淋巴管开始显影，45m in后显影清晰。正常肢体淋巴回流具有如下特点：①肢体淋巴链显影清晰，淋巴管呈规则的树枝状分布（图 1）；②淋巴液从肢体远端向近端单向向心性、“弹丸”式回流（图2）；③组织间隙显影清晰，未见淋巴管外显像剂分布；④区域淋巴结形态清楚（图1E、1F）。定量测量双侧肢体淋巴回流，结果显示双侧肢体淋巴回流速度及淋巴推进间隔相似，淋巴回流平均速度为0.7～0.8cm/s；淋巴推进间隔平均为37～40s。

2.2 淋巴水肿 根据肢体淋巴管结构特点、NIRF分布区域、淋巴回流状态、淋巴推进间隔时间及区域淋巴结是否显影等要点，NIRF淋巴显像将淋巴水肿分为4级。

Ⅰ级淋巴水肿的NIRF淋巴显像表现为（图3）：①小片状淋巴管外显像剂影；②主要淋巴管显示清晰，可见多条极度弯曲侧支淋巴管；③淋巴回流仍为“弹丸”式向心流动，回流速度较对侧正常肢体略减慢；④可出现“淋巴反流”；⑤区域淋巴结可显影。

图1 上肢正常淋巴引流。A～D分别显示了手背、前臂背面、前臂掌面及上臂侧面的淋巴回流的结构，可见淋巴管呈规则的树枝状分布，淋巴管外未见显像剂滞留。E、F分别显示肘部及腋窝淋巴结（箭头所示）（黑色避光胶布覆盖注射点）

Ⅱ级淋巴水肿图像（图4）：①组织间隙特征性出现絮状、云雾状的大片NIRF显像剂滞留现象；②可见毛细淋巴管网影及多条细小弯曲侧支淋巴管；③云絮状影间可见主淋巴管相互交通，但其回流速度减慢，推进间隔延长；④多可见“淋巴反流”，注射点远端（手掌及脚掌）出现NIRF显像剂；⑤淋巴结可或无显影。

Ⅲ级淋巴水肿图像（图5）：①树枝状淋巴管状结构消失，絮状、云雾状影遍及全部肢体。表明大量 NIFR显像剂滞留在组织间隙；②可见毛细淋巴管网及多条细小弯曲侧支淋巴管；③部分侧支淋巴管偶见“弹丸”式流动；④“淋巴反流”现象普遍存在，注射点远端可见大片状 NIRF显像剂；⑤无区域淋巴结显影。

Ⅳ级淋巴水肿图像：NIRF显像剂滞留于注射部位，患肢无淋巴管状结构及淋巴引流，区域淋巴结不显影；少部分患者NIRF显像剂可从注射点处逆流到皮肤表面。

图2 正常前臂背面可见规则的淋巴管结构（箭头所示），淋巴回流呈“弹丸”式（红色圆圈所示）向心性流动图3 下肢Ⅰ级淋巴水肿。A.小腿内侧NIRF显像图，小腿近膝部可见小片状淋巴管外显像剂滞留（短箭头所示），周围可见细小弯曲侧支淋巴管（长箭头所示），与主淋巴管相连；B.注射点周围多条极度弯曲侧支淋巴管（长箭头所示）；C.小腿内侧可见规则树枝状淋巴管结构，内可见“弹丸”式淋巴液流动（圆圈所示）；D.大腿内侧可见规则淋巴管，腹股沟可见淋巴结影（长箭头所示）（黑色避光胶布覆盖注射点）

图4 下肢Ⅱ级淋巴水肿。A.足部背部可见规则淋巴管结构（长箭头所示）；B.膝部特征性出现絮状、云雾状的大片NIRF显像剂滞留（短箭头所示）；C.小腿多处大片状云絮影（短箭头所示），其间见正常淋巴管相互交通（长箭头所示）；D.小腿背面可见絮状、云雾状的大片NIRF显像剂滞留，毛细淋巴管网影及多条细小弯曲侧支淋巴管隐约可见 图5Ⅲ级淋巴水肿表现。A、B.为前臂及小腿NIRF淋巴显像，图像显示规则淋巴管影消失，全部肢体可见絮状、云雾状淋巴管外显像剂影，其内可见毛细淋巴管网影。C、D.显示手掌及足底的“淋巴反流”现象，即注射点的远端（手掌及脚掌）出现显影剂

3 讨论

淋巴水肿是淋巴液回流障碍引起的组织间隙淋巴液异常增多的慢性进展性疾病。临床上通过病史、症状和体征，并采用排除法做出诊断。但对于疾病的严重程度、不典型病例的判断、疗效的评估，影像学仍是主要的诊断手段[9]。常用的影像学方法有X线淋巴造影、核素淋巴显像及磁共振成像等，静态反映了淋巴管的结构及功能。若需动态地、定量地观测淋巴回流状态，进行疗效实时监测，就需要一种新的影像手段——NIRF淋巴显像[1]。

NIRF淋巴显像是一种新的淋巴显像方法，具有不可比拟的显像优势：①具有极高的时间分辨率。NIRF染料能每秒发送1亿光子（放射性核素每秒发射1个光子），使实时、动态显示淋巴系统结构及功能成为可能；②能定量测量淋巴回流速度及淋巴推进间隔，有利于对比研究各种治疗方法及判定疗效；③NIRF染料可重复激发，行多次NIRF显像，有利于随诊监控疾病的进程及评估远期治疗疗效；④NIRF染料没有放射性，操作人员无放射性辐射；⑤显像设备简单，体积较小，价格低廉，有利于临床推广[7]。

本研究应用NIRF淋巴显像，首先分析了20例正常肢体淋巴系统的特点。结果显示，正常肢体通常具有规则淋巴管状结构，淋巴回流始终为向心性、“弹丸”式流动，淋巴管外并没有显像剂的滞留及毛细淋巴网影出现，区域淋巴结通常可清晰显影。随后，我们对20例肢体淋巴水肿的患者进行了NIRF淋巴显像。在对比疾病病程的病理生理学表现与淋巴水肿患者的图像后，我们发现不同级别淋巴水肿的影像学表现与疾病病程呈正相关。

在淋巴水肿早期，淋巴管道轻度阻塞，富含蛋白的淋巴在组织间隙轻度聚集，此时无组织纤维化或轻微纤维化，因此，NIRF图像上仅表现为少量显像剂滞留于淋巴管外。由于淋巴管道阻塞，机体将在淋巴管主干周围代偿产生发育不良的侧支淋巴管，这种新生小淋巴管较正常淋巴管不同，通常表现为细小并极度扭曲的管状结构。同时，淋巴管道的轻度阻塞将导致回流的淋巴液量减少，淋巴回流速度减慢，淋巴推进间隔轻度延长。区域淋巴结因能接收到淋巴回流从而显影。以上为Ⅰ级淋巴水肿的影像表现。

随着病程的延续，肢体多个部位的水肿和纤维化加重，不同程度地累及残留的正常淋巴管及淋巴管内瓣膜，使淋巴管壁的通透性下降，内部收缩力减弱，瓣膜功能不全，淋巴不能有效地引流到淋巴管中，甚至出现“淋巴反流”，因此病变部位处的组织间隙滞留了大量的淋巴液。随后，侧支循环增多，形成大片毛细淋巴管网影，淋巴主干内的淋巴回流减少、减慢。因此，Ⅱ级淋巴水肿NIRF图像上可见肢体多部位出现大片絮状、云雾状造影剂聚集在组织间隙中，显影剂周围可见细小弯曲的侧支淋巴管及毛细淋巴管网影。残存的淋巴管主干连接毛细淋巴管网，其内淋巴回流速度减慢，淋巴推进间隔明显延长。由于“淋巴反流”，注射点远端，如手掌或脚掌，出现NIRF显像剂。

皮下组织纤维化易引发并发症——淋巴管炎和蜂窝织炎，进一步加剧皮下组织纤维化的速度，淋巴管完全阻塞，大量淋巴液滞留于组织间隙中。因此，Ⅲ级淋巴水肿时，肢体的正常淋巴管状结构消失，取而代之的是遍及肢体的毛细淋巴管网影及皮下大量絮状、云雾状显像剂滞留。“淋巴反流”现象显著，注射点的远端（手掌及脚掌）可见显像剂。引流区域内将无淋巴结显影。

Ⅳ级淋巴水肿时，皮肤组织极度纤维化，常伴有严重表皮角化及棘状物生成，形成象皮肿。此时，造影剂仅停留在注射点处，甚至连同淋巴液顺着注射点反流到皮肤表面。

综上所述，NIRF淋巴显像诊断淋巴水肿的诊断要点如下：①淋巴管外是否有NIRF显像剂的滞留；②是否出现极度弯曲的侧支淋巴管及毛细淋巴管网；③树枝状淋巴管结构是否存在；④淋巴回流速度是否减慢，推进间隔时间是否延长；⑤是否出现“淋巴反流”现象，注射远端是否出现造影剂；⑥区域淋巴结是否显影。其中，以要点①作为区分水肿与非水肿的关键节点。

NIRF淋巴显像能实时、动态显示淋巴系统的结构及功能，较好地揭示各级淋巴水肿患者的显像特点及与疾病病程的关系，对肢体淋巴水肿具有较好的诊断价值。然而，本研究例数过少，不能揭示各级淋巴水肿的淋巴引流速度及推进间隔时间的差异是否有统计学意义，故需要进一步行大样本临床研究。

[1] Sevick-Muraca EM, Rasmussen JC. Molecular imaging w ith optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. J Biomed Opt, 2008, 13(4): 041303.

[2] Hirche C, Murawa D, Mohr Z, et al. ICG fluorescenceguided sentinel node biopsy for axillary nodal staging in breast cancer. Breast Cancer Res Treat, 2010, 121(2): 373-378.

[3] Sevick-Muraca EM, Sharma R, Rasmussen JC, et al. Imaging of lymph flow in breast cancer patients after microdose adm inistration of a near-infrared fluorophore: feasibility study. Radiology, 2008, 246(3): 734-741.

[4] Hirche C, Dresel S, Krempien R, et al. Sentinel node biopsy by indocyanine green retention fluorescence detection for inguinal lymph node staging of anal cancer: prelim inary experience. Ann Surg Oncol, 2010, 17(9): 2357-2362.

[5] Murawa D, Hirche C, Dresel S, et al. Sentinel lymph node biopsy in breast cancer guided by indocyanine green fluorescence. Br J Surg, 2009, 96(11): 1289-1294.

[6] Unno N, Inuzuka K, Suzuki M, et al. Prelim inary experience w ith a novel fluorescence lymphography using indocyanine green in patients w ith secondary lymphedema. J Vasc Surg, 2007, 45(5): 1016-1021.

[7] Sharma R, Wang W, Rasmussen JC, et al. Quantitative imaging of lymph function. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 292(6): H3109-H3118.

[8] Sharma R, Wendt JA, Rasmussen JC, et al. New horizons for imaging lymphatic function. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1131(5): 13-36.

[9] Tiwari A, Cheng KS, Button M, et al. Differential diagnosis, investigation, and current treatment of lower limb lymphedema. Arch Surg, 2003, 138(2): 152-161.