高效液相色谱法定量测定鸵鸟油中的EPA、DPA

杨秀芳, 闫倩茹, 伍发云

(教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室, 陕西科技大学化学与化工学院, 陕西 西安 710021)

0 引 言

多不饱和脂肪酸(PUFA)是指含有两个或两个以上双键，碳链中碳原子数大于或等于18的脂肪酸、如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(简称EPA)、二十二碳六烯酸(简称DHA)和二十二碳五烯酸(简称DPA)等.一般认为多不饱和脂肪酸在人体生理中起着极为重要的作用，若膳食中摄入不足或机体代谢缺陷，将会导致现代诸多文明病.尤其是EPA、DHA、DPA被称之为“脑黄金”， 不仅是构成高等动物细胞的重要成分之一，而且可降低血清胆固醇，减少心脑血管疾病[1]，对于癌细胞也有抑制作用[2].目前EPA、DHA、DPA等的唯一商业来源是海洋鱼油[1]，故PUFA已成为当前功能性脂肪酸研究与开发的主体和核心.有关鸵鸟油脂肪酸的组成在文献[3]中已有报道，为进一步探究其PUFA组成，本文应用HPLC对所获得的鸵鸟油进行了分析，结果表明鸵鸟油中含EPA和DPA，这为拓宽鸵鸟油的应用市场和提高其应用价值提供了理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

鸵鸟油(1号油：非洲鸵鸟油，乙醚提取的新鲜油；2号油： 非洲鸵鸟油，乙醚提取的冰冻油；3号油：澳洲鸵鸟油，即鸸鹋油，乙醚提取的新鲜油；原材料由陕西省英考鸵鸟股份有限公司提供).

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国Waters公司)：包括510型高压泵、HW-2000型色谱工作站、MILI-Q超纯水制备装置、超声波清洗器、溶剂过滤器、微孔滤膜(0.22 μm)等；HD-2004型紫外检测仪(上海嘉鹏科技有限公司)；R502B型旋转薄膜蒸发仪(上海申生科技有限公司).

色谱标准品(含量不少于99%)：EPA(20∶5n-3)、DPA(22∶5n-3)、DHA(22∶6n-3)由美国 Sigma公司提供，乙腈(色谱纯)，α-溴苯乙酮(连云港达瑞化工厂).

1.3 试验方法

1.3.1 最佳紫外波长的测定

用紫外检测仪测定3种标准品的紫外吸收波长，结果EPA、DPA和DHA的最佳紫外吸收波长均为252 nm.

1.3.2 色谱分析条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μL)，柱温：室温(25 ℃)，流速：1.0 mL/min，检测波长：252 nm，进样体积：20 μL，检测器：481型紫外-可见光检测器.

1.3.3 样品游离脂肪酸的制备

秤取10 g干燥鸵鸟油于三口烧瓶中，加入1 mol/L氢氧化钠乙醇溶液，58 ℃水浴搅拌1 h.倒入烧杯冷却至室温，加入石油醚搅拌然后放入冰箱使其脂肪酸钠盐充分析出.用布氏漏斗抽滤使脂肪酸钠与石油醚溶解的不皂化物分离，将脂肪酸钠盐用少量蒸馏水溶解，缓慢滴加10 mol/L的盐酸，直到下层溶液的pH值为2～4，此时上层为游离脂肪酸.转入分液漏斗，用石油醚萃取上层溶液，蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发器上回收石油醚，即得样品游离脂肪酸(FFA).

1.3.4 柱前衍生化

量取样品游离脂肪酸溶液0.1 mL于试管中，分别加入0.2 mLα-溴代苯乙酮的丙酮溶液和0.2 mL三乙胺的丙酮溶液，振荡混匀，氮气保护，密封试管，置于70 ℃水浴25 min，冷却后加入0.1 mL 醋酸丙酮溶液，反应完后用氮气将有机溶剂吹干，加入流动相复溶至10 mL.取20 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以外标法定量.

2 结果与分析

2.1 标准色谱图

在选定的色谱分析条件下，将3种标准品进样分析，结果见图1，可见EPA、DHA和DPA均能得到很好的分离，同时EPA、DHA和DPA保留时间分别为13.307 min、16.651 min和21.778 min.

图1 EPA、DHA和DPA的标准谱图 图2 1号鸵鸟油中EPA、DHA和DPA的色谱图

2.2 标准曲线和线性范围

以脂肪酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制EPA、DPA和DHA的标准曲线并进行线性回归.从EPA、DPA和DHA的线性回归方程可以看出，3种脂肪酸的浓度峰和面积的线性相关性密切，三者的线性回归方程分别为：

EPA：Y= 6.675×105X，r= 0.999 934； DPA：Y= 6.741×105X，r= 0.999 747； DHA：Y= 4.384 ×105X，r= 0.999 947.

2.3 样品谱图

2.3.1 1号鸵鸟油分析结果

称取一定量的1号鸵鸟油按1.3.3制备出FFA，将FFA配成50 mL乙腈溶液，取0.1 mL FFA乙腈溶液进行衍生化后用HPLC测定其中EPA、DHA和DPA的含量，结果见图2.分析后可知1号鸵鸟油衍生物中EPA和DPA含量很低，分别为0.007 2%和0.022%，其中不含有DHA.

2.3.2 2号鸵鸟油分析结果

按1.3.3称取一定量的2号鸵鸟油制备FFA，并配成50 mL乙腈溶液，衍生化后用HPLC测定其中EPA、DHA和DPA的含量，结果见图3，显示2号鸵鸟油衍生物中EPA和DPA含量分别为0.003 3%和0.030%.

图3 2号鸵鸟油中EPA、DHA和DPA的色谱图 图4 3号鸵鸟油中EPA、DHA和DPA的色谱图

2.3.3 3号鸵鸟油分析结果

按1.3.3称取一定量的3号鸵鸟油制备FFA，配成50 mL乙腈溶液，衍生化后用HPLC测定其中EPA、DHA和DPA的含量，结果如图4所示，3号鸵鸟油衍生物中EPA和DPA的含量分别为0.004 9%和0.059%，其中不含有DHA.

3 结 论

利用HPLC测定了3种鸵鸟油中长链不饱和脂肪酸EPA、DPA和DHA的含量.采用α-溴苯乙酮作为衍生剂，对标准品和样品进行柱前衍生化，在脂肪酸分子中引入具有紫外吸收的基团.检测结果表明，在3种鸵鸟油中都检测出EPA和DPA，但均未检测出DHA，其中1号鸵鸟油中EPA含量为0.007 2%，DPA含量为0.022%；2号鸵鸟油中EPA含量为0.003 3%，DPA含量为0.030%；3号鸵鸟油中EPA含量为0.004 9%，DPA含量为0.059%.

参考文献

[1] 徐天宇.利用生物技术生产二十碳五烯酸和十二碳六烯酸[J].食品与发酵工业，1995，(l):56-64.

[2] Hinton A Jr， Ingram KD. Use of oleic acid to reduce the population of bacterial flora of poultry skin[J]. J. Food Prot, 2000, 63(9): 1 282-1 286.

[3] 杨秀芳,伍发云,马养民,等．鸵鸟油理化性质及脂肪酸组成分析[J]．中国油脂，2010，35(1)：77-79．