25例慢性心力衰竭患者炎症细胞因子的变化

刘家勉,刘应才

（1.四川省乐山市人民医院心内科 614000；2.泸州医学院附属医院心内科,四川646000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）的机制目前尚未完全清楚。近年来发现炎症细胞因子的大量分泌以及核因子-κ B（NF-κ B）的活化在CHF的发生和发展中起十分重要的促进作用[1-7]。本文通过对CHF患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）在脂多糖（LPS）的刺激下进行体外培养,观察CHF患者PBMCs分泌细胞因子水平和NF-κ B活性的变化,以及两者的关系,从而探讨CHF的发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择泸州医学院附属医院心内科2007年6月至2007年12月住院的CHF组患者25例,其中男18例,女7例,年龄（61.3±10.1）岁。心功能NYHA分级Ⅲ～Ⅳ级,Ⅲ级19例,Ⅳ级6例,经超声心动图测定LVEF＜45%。扩张性心肌病16例,缺血性心肌病5例（有典型心绞痛表现或经冠状动脉造影明确有冠状动脉病变）,高血压性心脏病4例；病程6个月至12年。健康对照组25例,其中男18例,女7例,年龄（60.4±9.6）岁,为泸州医学院附属医院门诊健康体检者。两组均排除风湿活动、自身免疫性疾病、肿瘤、感染、糖尿病等。近1周未服用β受体阻滞剂,已服用者需停药1周以上。

1.2 实验材料 Ficoll hypaque淋巴细胞分离液（上海华精生物高技有限公司产品）,胎牛血清（GIBCO公司）,PRMI-1640培养基（GIBCO公司）,白细胞介素-1β（IL-1β）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）放射免疫试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）,LPS（Sigma公司）,NF-κ B p65试剂盒（武汉博士德公司）等。

1.3 实验方法 CHF患者及健康体检者抽取空腹12h肘静脉血5mL,应用淋巴细胞分离液（Ficoll hypaque,密度为1.077）分离单个核细胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（含2mmoL谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μ g/mL链霉素）悬浮细胞,加入24孔培养板。置入37℃、5%CO2饱和湿度的孵育箱中,2h后加入LPS（1μ g/mL,细胞终浓度为1× 106个/升）。刺激24h后应用放射免疫法测定培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平,留取PBM Cs检测NF-κ B活性。

1.4 细胞因子检测 培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α检测采用解放军总医院放免所试剂盒,由泸州医学院附属医院核医学科协助测定。

1.5 NF-κ B检测 将培养后离心的PBMCs加入完全培养基洗涤两次,每次以1000r/min离心10min,末次离心后的细胞加入完全培养基调整细胞数为1×107个/毫升,用毛细吸管吸取30μ L细胞悬液涂于用多聚赖氨酸处理过的玻片上,室温风干。将细胞涂片用纯丙酮固定30min,再次风干后将标本置于-70℃冰箱中保存待测。PBMCs NF-κ B免疫组化染色使用武汉博士德生物工程有限公司的NF-κ B p65试剂盒,采用生物素-链霉亲和素免疫组化染色法。NF-κ B活性检测：随机选取5个高倍视野,细胞核呈棕黄色定为NF-κ B阳性细胞,共计500个细胞,计算阳性细胞占总计细胞的百分率。

2 结果

2.1 两组细胞因子水平及NF-κ B活性比较 CHF组各细胞因子水平及NF-κ B活性均明显升高,见表1、封3图1。

表1 两组细胞因子及NF-κ B活性

2.2 相关性分析 PBMCs NF-κ B阳性细胞率与培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈显著正相关,见表2。

表2 PBMCs NF-κ B阳性细胞率与细胞因子相关性

3 讨论

CHF患者外周血中以及心肌局部有大量的炎性细胞因子分泌[8]。炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β可通过一系列调控机制,如促进心肌细胞凋亡、左室重塑,使心肌β-肾上腺素能受体失耦联等参与心力衰竭的进展[9]。NF-κ B是一种分布和作用十分广泛的真核细胞转录因子。多种炎症因子受到NF-κ B调控,包括TNF-α、IL-1、IL-2、一氧化氮合成酶（NOS）、IL-6等。在多数细胞中,NF-κ B与其抑制蛋白结合,当受到活化刺激后,NF-κ B解离进入细胞核,与多种炎症因子启动子区域中κ B序列结合,参与炎症介质、黏附分子等转录[10],诱导免疫细胞的活化、应激性反应及细胞凋亡等多种细胞活动。Anlonella等[6]发现CHF患者的外周血白细胞中活化的NF-κ B明显高于健康人群。急性冠状动脉综合征患者PBMCs NF-к B活性显著高于稳定型冠心病和无心血管病的健康对照组[11]。既往研究也证实NF-к B p65在CHF患者的PBMCs中的表达较正常人明显增加[12]。

PBMC是CHF时炎性细胞因子的重要来源[13]。细菌LPS是人PBM Cs分泌细胞因子强大的诱导剂[14],CHF患者血浆LPS水平明显升高,故研究PBMCs分泌细胞因子水平,对反映CHF患者血液循环内炎症情况有重要意义。细胞核上表达NF-κ B的细胞数可作为判断NF-κ B活化标志[15]。本研究结果显示,CHF患者PBMCs NF-κ B阳性细胞率显著高于无心血管病史的健康体检者,提示NF-κ B的激活可能是心力衰竭的病理生理特征,可能与心力衰竭进程有关。IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高,表明心力衰竭患者体内存在明显的炎症反应。相关分析显示,NF-κ B阳性细胞率与IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈显著正相关,说明心力衰竭时PBMCs分泌细胞因子增加,NF-κ B信号转导通路的转录调节是心力衰竭炎症激活的可能机制,并以此途径参与心力衰竭的进展,提示通过抑制NF-κ B活性、降低细胞因子转录可干预心力衰竭进程。

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