人肝癌SMMC-7721细胞培养体会①

王玥 李应东

(甘肃中医学院 兰州 730060)

目前细胞培养技术已成为很重要的生物技术之一,它是医学、新药开发等实验研究的基础技术,其作用不容忽视。人肝癌SMMC-7721细胞属于肝癌细胞系,现已广泛用于药物毒理、抗肿瘤等方面的研究,目前关与人肝癌SMMC-7721细胞的培养文献还比较少,我们对于人肝癌SMMC-7721细胞的培养条件和方法上进行了探索,现总结出一些经验。

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验细胞 人肝癌SMMC-7721细胞株由甘肃兰州大学附属二院泌尿研究所惠赠。

1.1.2 主要试剂 Dulbcco’s Modified Eagle’Medium(DMEM)培养基:北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司磷酸盐缓冲液(PB S):氯化钠8.00g、十二水磷酸氢二钠2.885g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钾0.20、三蒸水配制,0.22μm滤膜过滤除菌,PH7.2～7.4,4℃保存。新生牛血清(NBCS):杭州四季青生物材料工程研究所-20℃保存,使用前4℃溶解,56℃灭活30min。胰蛋白酶消化液:胰蛋白酶(T rypsin 1:250,GIBCO公司)用PBS液配制成浓度为0.25%溶液,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。青霉素、链霉素溶液:0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。

1.1.3 实验仪器 二氧化碳培养箱:BB16UV德国Heraeus公司;超净工作台:VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司;倒置相差光学显微镜:IX71型,日本Olympus公司产品;恒温水浴锅:DZW-4型,金坛市恒丰仪器厂;纯净水系统:Milli-Q Biocel美国Millipore公司;电热恒温干燥箱:风热式,101型,北京科伟永鑫实验仪器设备厂;台式灭菌器:TMQ.J-2540型,山东新华医疗器械股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721细胞的复苏方法 将冻存的细胞用镊子捏住在提前预热的37℃水浴锅中快速摇晃将细胞解冻,整个过程一般不要超过2min,然后将细胞用尖吸管转移至细胞培养瓶中(复苏的时候细胞最好不要分瓶),密度一般为1×104cell/mL为宜。缓慢加入8～10倍体积的含10%胎牛血清[1]、双抗溶液(浓度一般保持0.1%)的DMEM培养基(含4.0mm L-谷氨酰胺、1000mg/L葡萄糖、110mg丙酮酸钠经0.1μm无菌过滤)进行稀释,用尖吸管吹打50次将细胞吹散,培养瓶经酒精擦拭就可以放入5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。刚复苏的细胞比较脆弱在复苏的24h内最好不要观察,以免晃动影响细胞贴壁。24h后一般大多数贴壁细胞已经贴壁,这时一定要换成新鲜的培养液,不然冻存液中的DMSO会对细胞造成损伤,在我们的实验中发现48h后不除去DMSO会使SMMC-7721细胞丧失原来的细胞形态变圆从而停止生长。

1.2.2 SMMC-7721细胞的传代方法 细胞一般铺满瓶底80%左右就可以进行传代了。SMMC-7721细胞形态一般为花瓣状,如果细胞数目过多未及时传代可以观察到细胞分为2层:上层为圆形细胞层,下层为花瓣形细胞层。我们实验室采用的传代的具体方法如下:先用已过滤的预冷PBS溶液洗细胞2次,再加入0.25%的胰酶溶液1mL来回轻晃培养瓶用封口膜封口后在显微镜下观察,待大部分细胞变圆后(一般2min左右)立刻竖起培养瓶使细胞脱离胰酶溶液,经酒精擦拭拿回超净台,用尖吸管将胰酶吸出(此时尽量不要直接倒掉胰酶因为细胞经消化已经贴壁不牢了,直接倒掉会损失一部分细胞)。最后根据你要传的瓶数加入相应的培养基用尖吸管吸取培养基从培养瓶爬满细胞的那面由上往下吹打。我们一般采取1∶3的传代方式,细胞生长良好,3d后长满瓶底。

1.2.3 SMMC-7721细胞的冻存方法 在细胞生长良好的时期一般为对数生长期我们要对细胞进行冻存,如果实验中出现污染可以提供健康的细胞来源。下面来谈谈冻存的方法:冻存前首先我们要配置冻存液,我们采用的冻存液的比例是1mL的冻存液中含0.5mL的血清、0.4mL的新鲜培养基、0.1mL的DMSO。刚配制的冻存液不能直接加入细胞内,因为DMSO会释放出大量的热会对细胞产生损伤。具体方法如下:将生长良好的SMMC-7721细胞(约为80%～90%致密度,浓度为1×105cell/mL)先用PBS溶液洗2次,用0.25%的胰酶如前面所述的方法将细胞从瓶壁上消化下来移入离心管中800转离心5min,用尖吸管吸去上清,加入已配置好的冻存液,最后将细胞吹散移入冻存管中封口、标记好细胞的种类及冻存日期,先放入4℃冰箱10min再转入-20℃30min,然后放入-80℃冰箱过夜,最后取出放入液氮槽中长期贮存。如果实验室没有液氮罐,可以在4℃冰箱放30min转入-20℃2h最后放入-80℃冰箱,这样贮存方法可以贮存半年左右。冻存后的细胞经过一段时间可以拿出来复苏一瓶,观察细胞的生长情况。

2 讨论

2.1 复苏是否采用离心的方法

有些文献[2]报道细胞复苏时采用用离心的方法去掉冻存液,鉴于刚复苏的细胞很脆弱离心会对细胞产生一定的损伤,故认为复苏时不离心,第2天换液为佳,因为10%的DMSO短期并不会对细胞造成影响,经此方法复苏的SMMC-7721细胞存活率较高一般达80%以上。

2.2 消化方法的改进

消化时如果单纯用胰酶消化时间很难把握,若消化过度,细胞不容易贴壁,48h后仍不贴壁示为死细胞。若消化不完全用尖吸管吹打细胞很难吹下细胞。长时间吹打也会对细胞造成损伤,这样传代还会引起每瓶细胞数目不均一,用PBS洗后消化时间易于掌握,提高细胞的活力。

2.3 冻存液的配制方法改进

以往相关资料中[3]报道冻存液里含90%的培养液(含血清20%)和10%的DMSO,由于细胞冻存会使细胞变的脆弱活力下降,应当加大血清的含量以保证复苏后的细胞活力较好,复苏的成功率较高,目前也有学者采用90%的血清加10%的DMSO配成冻存液认为这样供给细胞更多的营养会更利于复苏后细胞的成活。

2.4 复苏后细胞不贴壁的原因分析

复苏后的贴壁细胞24h后80%以上的细胞都会贴壁,不贴壁的细胞可能已经死亡,主要有以下3方面的原因:(1)冻存前的细胞已经存在污染;(2)冻存方法不正确主要可能是加入血清过少或者冻存温度时间错误;(3)细胞复苏时离心时间过长转速过高或细胞贴壁后未及时去除冻存液从而对细胞造成损伤。

一般SMMC-7721细胞在复苏后4d左右贴壁率达90﹪以上,就可进行传代,传代后的细胞生长较迅速,3d左右基本可以铺满瓶底,经过2、3次传代细胞稳定后,生长状态良好时就可以对细胞进行临床毒理性试验研究、细胞核型分析、及提取总蛋白进行蛋白印记分析等各种操作。

3 总结

在人肝癌SMMC-7721细胞培养过程中最为关键的技术还是无菌操作,一切的步骤都建立在其基础之上。对培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、均要进行严格的消毒,无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。

[1]张卓然.实用细胞培养技术[M].北京:人民卫生出版社,1999:11～27.

[2]唐孟萱,周万军,胡元佳,等.HepG2细胞培养方法与条件的探索[J].实用预防医学,2005,12(1):71～73.

[3]李燕,张键,于江天.细胞与分子生物学常用实验技术[M].西安:第四军医大学出版社,2009:7.