脐血间充质干细胞治疗帕金森病的研究进展

武晓华,陈乃耀

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统变性疾病,该病主要病理特点为中脑黑质多巴胺能神经元(dopaminergic neuron,DN)严重缺失和纹状体多巴胺神经递质减少。目前临床以药物治疗和手术治疗为主[1]。不论是递质替代还是外科手术均不能逆转神经变性,不能重新增加多巴胺能神经细胞的数目。相反,由于左旋多巴的神经毒性、电极的刺激还会使神经细胞的数目进一步减少。因此,寻求一种从病理基础上提高神经系统细胞数目的治疗具有重要意义[2]。成体干细胞横向分化的多潜能性为 PD的治疗提供了新的思路和方法[3]。脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)是从脐带血中分离和培养的一种多潜能成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,在一定条件下可以分化成为神经元细胞。目前,根据UCB-MSCs的这些特性,应用UCB-MSCs治疗神经系统疾病如神经退行性疾病,神经损伤和中风等的基础和临床研究已成为热点,并取得了一定进展。

1 UCB-MSCs的生物学特性

人脐血是指脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和前体细胞,其主要包含造血干细胞和MSCs。经研究发现脐血中含有丰富的MSCs,其特性主要有:①细胞形态呈均一的长梭形,核浆比例大,细胞内含有丰富的细胞器,端粒酶活性高,增殖能力强,具有贴壁生长的特点;②适当诱导培养条件下,具有谱系内多向分化的特点和跨系分化的潜能;③表达 CD13、CD29、D44、CD54、CD58、CD90、CD95、CD105、CD166等免疫表型,不表达 CD14、CD34、CD40、CD45、CD50、CD68、CD80、CD86、CD117和 CD152等免疫表型;④强阳性表达抗原标记SH-2、SH-3、SH-4(人间充质干细胞特异性抗体),同时表达HLA-ABC等抗原和胶原Ⅰ,不表达HLA-DR抗原、共刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40/CD40L以及胶原Ⅱ、Ⅲ;⑤细胞多处于G0/G1期,具有良好的增殖分化能力,简便易行的分离、纯化程序,而且能分泌一些造血细胞因子,具有促进造血的作用;⑥是一种原始的免疫缺陷细胞,具有良好的免疫耐受性,同时有一定的免疫调节作用,能够抑制T细胞活性。

2 UCB-MSCs应用于细胞移植所具备的条件

UCB-MSCs可应用于细胞移植,因其具备以下优点:①来源广泛,采集方便,不会对供者造成任何伤害。②其中的干/祖细胞较骨髓中的干/祖细胞更原始,增殖分化能力更强。③淋巴细胞的免疫功能不够成熟,移植物抗宿主病发生率较低。④微生物和肿瘤细胞污染的可能性小。⑤无社会、伦理及法律等方面的诸多争议。⑥易于保存和运输。⑦收集的脐血不仅可做异基因移植的供体,而且还可将之低温保存数十年,用于自体移植治疗相关疾病。这些优点使UCB-MSCs成为细胞移植理想的种子细胞,有着广泛的临床应用前景。

3 UCB-MSCs向DN分化的研究

研究表明,在特定的条件下,UCB-MSCs经过诱导在体内和体外均可分化为神经元样细胞,并表达一些神经标志性蛋白。UCB-MSCs的分化机制还不完全清楚,UCB-MSCs在其细胞的基因组内有几套“程序”,在不同的外界环境下,会有相应的一套基因开启,从而分化成某种终末细胞;还有人认为 UCB-MSCs是通过与不同组织的细胞发生融合而实现向该组织分化的,UCB-MSCs跨胚层分化时需要通过细胞融合这一过程来最终分化成这些组织的特定细胞。

3.1 UCB-MSCs体外诱导分化为神经细胞 近年来,国内外学者对UCB-MSCs诱导分化为神经细胞的方法进行了大量研究,目前UCB-MSCs体外诱导分化为神经细胞的方法主要有:①细胞生长因子法,神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等;②化学诱导剂法,B-巯基乙醇(B-ME)、二甲基亚砜(DM SO)、丁羟基苯甲醚(BHA)等;③生长因子与化学诱导剂联合;④其他,共培养或用接近生理状态的条件培养液、基因转染[4]、传统中药黄芩苷[5]等。Goodwin等[6]将第4代的UCB-MSCs以完全培养基加20 ng/mL bFGF,20 ng/mL EGF诱导7 d细胞形态发生明显变化,细胞免疫化学及Westen blot均证实有细胞骨架蛋白B-tubulinⅢ,星形细胞胶质纤维酸性蛋白的表达。侯玲玲等[7]以DM EM/20%胎牛血清/和B-巯基乙醇(B-M E)预诱导 24 h,而后换二甲基亚砜(DMS0)和丁羟基苯甲醚(BHA)进行诱导UCB-MSCs 5 h后70%细胞呈现典型的神经元样表型,免疫组化法检测发现不同代数的MSCs均为神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微丝蛋白M(NF-M)阳性,诱导6 h～8 h后组织化学检测可见神经元特有结构尼氏体。Sanchez等[8]在N5神经生长培养基中,采用维甲酸(RA)和 NGF诱导 UCB-MSCs后,新生细胞在形态上接近神经细胞,并表达神经巢蛋白(nestin)、GFAP、NSE等神经细胞标志物。Jeong等[9]用 bFGF预诱导后,再用 DMSO、BHA联合诱导 UCB-MSCs,细胞迅速向神经细胞快速分化,诱导后细胞呈现神经元样形状,免疫荧光检测显示,神经前体细胞标志巢蛋白呈阳性,成熟神经细胞标志物神经胶质细胞标志物。

以上研究证明,UCB-MSCs在不同培养条件或不同的因子作用下,可分化为具有神经元形态并表达神经元标记物的细胞,体外诱导UCB-MSCs的技术正趋于完善。

3.2 UCB-MSCs在体内向神经细胞分化 Dunyue等[10]在HUCB对脑外伤鼠模型的静脉治疗中取得成功,并在脑实质中检测到被标记的神经元和星型胶质细胞。Ha等[11]和Chen等[12]将HUCB-MSCs静脉输注到大脑中动脉梗死(MCAO)大鼠体内,发现移植的M SCs存活,部分表达神经细胞特异性标志物GFAP、NeuN、MAP-2,接受移植的动物运动功能和NSS均有显著改善。Willing等[13]将UCB-MSCs移植入局灶性脑缺血成年大鼠24 h后观察到,成年大鼠记忆功能改善。吴芳等[14]对小儿脑瘫患者应用 UCB-MSCs鞘内注入的治疗方法,1次/周,治疗4周后患儿的粗大运动功能中卧位与翻身、坐位、行走与跑跳功能及小腿三头肌肌张力均得到明显改善。

UCB-MSCs通过不同方式移植到动物模型体内,可在体内微环境中分化为神经细胞或星形胶质细胞,并使运动功能明显改善。UCB-MSCs经体外诱导分化形成的神经元样细胞在移植后仍可存活、增殖并迁移。

4 UCB-MSCs移植治疗PD的研究现状

4.1 UCB-MSCs移植治疗PD的研究 细胞移植治疗PD的目的是修复黑质神经元变性引起的纹状体多巴胺能通路损伤。移植DN替代已经变性的神经元,恢复黑质纹状体多巴系统的完整性并改善其功能,很可能是一项非常有前途的治疗措施[15]。吴立克等[16]给患者应用 UCB-MSCs进行鞘内注射移植治疗,以第3,4腰椎间隙为穿刺点,缓慢注入地塞米松2 mg,取UCB-MSCs注射液5 mL(干细胞数 500万),在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔,1次/周,4次为1个疗程,共治疗1个疗程。可以一定程度地改善PD患者的临床症状,提高患者生活质量。黄仕雄等[17]利用 Nurrl基因修饰HUCB-MSC来源的DN,移植入PD模型鼠纹状体内,能有效地改善PD模型鼠的症状,提高移植后DN的整合及存活能力,保护了毁损纹状体内残存的DN。Fu等[18]研究报道,将源于人脐血的 MSCs在体外诱导分化成为DN,把转化来的细胞移植到大鼠体内(这种大鼠是通过施加6-OH多巴胺神经毒素而人造的单侧纹状体损害的PD模型),在移植后的4个月,酪氨酸羟化酶染色在大鼠的新纹状体内检测到了移植的细胞,结果显示,UCB-MSCs有可能用于治疗PD。樊志刚等[19]将第三代 UCB-MSCs用Hoechst33258标记后植入大鼠纹状体内,结果发现移植组较对照组阿扑吗啡诱发的旋转行为显著改善,认为UCB-MSCs脑内移植能改善帕金森大鼠的行为缺陷,可作为治疗神经变性性疾病的一种潜在的细胞资源。

4.2 UCB-MSCs治疗PD的可能机制 尽管UCB-MSCs在神经系统的许多疾病如:脑梗死、脑损伤、脊髓损伤、神经系统变性疾病的细胞移植治疗方面取得了很大的进展,但其在促进神经功能恢复方面的作用机制尚不完全清楚。目前认为UCBMSCs治疗 PD的机制可能有:①UCB-MSCs移植入脑后,能形成表达神经标志性蛋白的神经元样细胞或星形胶质细胞,产生的细胞可在受损部位周围存活,甚至移行至全脑[20]。②UCBMSCs在中枢神经系统微环境下能分泌脑源性神经营养因子(BDNF)、bFGF等营养因子,或者刺激损伤部位产生内源性因子,促进损伤组织的修复并减少细胞凋亡。③UCB-M SCs是受损部位新生血管的主要组成细胞,可分化成血管内皮细胞和细胞外基质,帮助神经保护、促进血管发生[21]。④在脑内创造适宜的局部微环境,通过体外扩增或不同因子诱导分化的方法使UCB-MSCs分化为神经细胞后进行移植,替代受损细胞重建神经功能区和传导通路[22]。

4.3 UCB-MSCs移植的方法及影响因素

4.3.1 移植途径和方法 UCB-MSCs移植的途径有:通过脑立体定位仪将 UCB-MSCs注入侧脑室、纹状体、海马等;直接注射入脑室或蛛网膜下腔,通过脑脊液的流动将细胞带到病变部位;注射入静脉或动脉,使其通过血脑屏障到达病变部位,主要应用于鼠尾静脉注射。

UCB-MSCs移植治疗PD的方法主要有:一是将未诱导或修饰过的UCB-MSCs直接移植入体内,利用体内环境的信号诱导分化为合适的细胞[16]。另外一种方法是移植经过诱导或基因修饰过的UCB-MSCs,使其分化为所需要的神经细胞后再移植入体内[17]。

4.3.2 影响因素 UCB-MSCs的选取、分离培养方法,分化为神经细胞的效率,移植细胞的类型、数量、合适的比例、合适的移植位点,UCB-MSCs对细胞外环境的影响以及细胞外环境对UCB-MSCs的影响,脑中内源性因子的作用以及UCB-MSCs在脑内存活时间对移植疗效均有一定的影响。Karen等[23]发现,UCB-MSCs分离较为合适条件是,样本保存时间不超过15 h,样本中血液体积要超过33 mL,并且血液中没有血凝块合胰酶,单份血液中的 MSC要超过108。Buzanska等[24]将贴壁后的UCB-MSCs在含EGF培养基中培养6周,获得nestin阳性的细胞集落,随后将这种细胞分别用多聚左旋赖氨酸、视黄酸和BDNF诱导,可分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞;若与大鼠脑原代培养单层细胞共培养,也可获得神经元和神经胶质细胞。Fu等[18]通过实验发现,源于人脐血的MSCs在神经培养基(NCM)、SHH、FGF8中通过分步培养,可以诱导分化成为12.7%的DN,移植至PD模型鼠纹状体后,旋转数显著减少至对照组的水平,但不能恢复到正常水平,移植的多巴胺能神经元的数量不足是其主要原因,荧光显示跟踪发现标记的细胞大多定位于前囟点前2.0到后0.6,从移植位置开始迁移了大约1.4 mm,几乎贯穿了整个纹状体。Sawamoto等[25]研究发现人脐血来源MSCs能够在实验组大鼠脑内长期存活(至少8周以上),且发生迁移,同时表达神经细胞抗原 NSE,GFAP,T H,并且实验组多巴胺含量明显增加,这表明MSCs在大鼠脑内微环境的作用下可模仿神经干/祖细胞的行为。因此在临床应用研究中除了用UCB-MSCs诱导分化而来的细胞替代缺乏或丧失功能的细胞外,也应该考虑联合培养多种细胞来重塑细胞外环境,从而提高移植细胞的存活和增殖分化的能力。

5 展 望

目前虽然对UCB-MSCs的研究已取得了较大进展,其在人类医学上的应用价值也已逐渐得到了肯定,但UCB-MSCs的研究尚处于起步阶段,仍存在许多尚待解决:尚未寻找到完善的分离、培养和扩增UCB-MSCs的方案。至今尚未筛选到其特异性的标记分子,仍未能建立鉴定 UCB-MSCs的统一标准。诱导UCB-MSCs向多系分化的分子机制有待进一步研究。在UCBMSCs的临床应用中,哪一分化阶段的细胞最适于移植?采用何种途径进行移植最佳?有待于进一步的探讨。在移植应用过程中,植入的UCB-MSCs分化生成的细胞是否能够融入相应的组织器官并发挥特定功能,具体作用机制如何?UCB-MSCs移植的近远期安全性问题,有无致瘤性等也亟待更完善的解决方案。UCB-MSCs治疗PD能否保持长期疗效,且与目前存在的其他治疗方法相比是否具有优越性?还有待进一步分析。尽管目前UCB-MSCs作为一种真正意义上的种子细胞还存在许多研究空白,但UCB的优势是其他取材来源所无法比拟的。相信随着UCB-MSCs研究的深入,其生物学特性会越来越明晰,在细胞治疗、基因治疗、组织工程及器官移植方面都会产生不可替代的作用。

[1]Lees AJ,Hardy J,Revesz T.Parkinson's disease[J].Lancet,2009,373(9680):2055-2066.

[2]Greene P.Cell-based therapies in Parkinson's disease[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2009,9(4):292-297.

[3]Lindvall O,Kokaia Z.Prospects of stem cell therapy for replacing dopamine neurons in Parkinson's disease[J].T rends Pharmacol Sci,2009,30(5):260-267.

[4]Jin GZ,Yin XJ,Yu XF,etal.Generation of neuronal-like cells from umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells of aRFP-transgenic cloned cat[J].Vet Med Sci,2008,70(7):723-726.

[5]管让宪,颜小华,陈启文,等.中药单体黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2787-2792.

[6]Goodwin HS,Bickness A,Chien S,et al.M ultilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:Expression of bone,fat,and neural markers[J].Biol B1ood Marrow Transplang,2001,7:581-588.

[7]侯玲玲,曹华,魏国荣,等.人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究[J].中华血液学杂志,2002,23(8):415-419.

[8]Sanchez-Ramos J,Song S,Kamath SG,et al.Expression of neural markers in human umbilical cord blood[J].Exp Neurol,2001,171(1):109-115.

[9]Jeong JA,Cang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiaton of human cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport,2004,15(11):173l-1734.

[10]Dunyue L,Paul R,Sanberg AM,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury[J].Cell T ransplantation,2002,11:275-281.

[11]Ha Y,Choi JU,Yoon DH,et al.Neural phenotype expression of cultured human cord blood cells in vitro[J].Neuroreport,2001,12(16):3523-3530.

[12]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[13]Willing AE,Lixian J,Milliken M,et al.Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke[J].J Neurosci Res,2003,73(3):296-307.

[14]吴芳,杨佳勇,张敏,等.脐血间充质干细胞移植对脑性瘫痪儿童神经系统功能的影响:20例分析[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(16):3198-3200.

[15]Hou L,Hong T.Stem cells and neurodegenerative diseases[J].Sci China C Life Sci,2008,51(4):287-294.

[16]吴立克,王晓娟,褚赛纯,等.脐血间充质干细胞移植治疗帕金森病30例[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(40):7951-7954.

[17]黄仕雄,刘军,文国强,等.Nurrl基因修饰人脐血间充质干细胞源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病[J].中山大学学报(医学科学版),2009,30(5):522-526.

[18]Fu YS,Cheng YC,Lin M Y,et al.Conversion of human umbilical co rd mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro:Potentialtjal therapeutic application for Parkinsonism[J].Stem Cells,2006,24(1):115-124.

[19]樊志刚,刘翔,白瑞樱,等.脐血干细胞移植对帕金森病大鼠神经功能恢复的影响[J].郑州大学学报(医学版),2006,41(4):646-648.

[20]Jin GZ,Cho SJ,Choi EG,et al.Rat mesenchymal stem cells increase tyrosine hy droxylase expression and dopamine content in ventral mesencephalic cells in vitro[J].Cell Biol Int,2008,32(11):1433-1438.

[21]Kim YJ,Park HJ,Lee G,et al.Neuroprotective effects of humanmesenchymal stem cells on dopaminergic neurons through anti-inflammatory action[J].Glia,2009,57(1):13-23.

[22]Bouchez G,Sensebe L,Vourch P,et al.Partial recovery of dopaminergic pathway after graft of adult mesenchymal stem cellsin a rat model of Parkinson's disease[J].Neurochem Int,2008,52(7):1332-1342.

[23]Karen,Susanne,Kluter H,et al.Critical parameters for the isolation of mesenchy mal stem cell from umbilical co rd blood[J].Stem Cells,2004,22(9):625.

[24]Buzanaka L,Machaj EK,Zablocka B,et al.Human cord blood-derived cells attain neuronal and g lial features in vitro[J].J Cell Sci,2002,115:2131-2138.

[25]Sawamoto K,Nakao N,Kakishita K.Generation of dopaminergicneurons in the adult brain from mesencephalic precursor cells labeled with a nestin-GFP transgene[J].J Neurosci,2001,21(11):3895.