代谢组学及其在心血管疾病中的研究进展

石 洁,胡元会

1999年英国皇家理工大学Nicholson教授及其同事首次提出代谢组学的概念[1]。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后,系统生物学的重要组成部分,是系统研究代谢产物的变化规律,解释机体生命活动代谢本质的科学。它通过高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术分析细胞、组织和体液中内源性代谢物整体组成,通过研究代谢物的动态变化来辨识和解析被研究对象的生理病理状态。随着代谢组学进一步的发展以及代谢多层次多方面的深入研究,代谢组学在心血管疾病中取得一些进展。本文就代谢组学及其在心血管疾病研究中的进展做一综述。

1 代谢组学基本概况

代谢组学是一门在新陈代谢的动态过程中,系统研究代谢产物的变化规律,解释机体生命活动代谢本质的科学。是一项动态的、多参数应答的新技术、新方法,反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总反映,是判定健康、疾病和治疗效果合适的分子集合。简而言之,基因组学和蛋白质组学告诉我们可能发生什么,而代谢组学则告诉我们已经发生了什么[2]。细胞内的生命活动离不开物质代谢,而基因、蛋白质的生命调控效应最终也需落实在代谢层面上,因此,代谢组学被认为是基因组学和蛋白质组学的延伸,是“组学”研究的最终方向,它跳过生命体内的复杂调控过程,通过对代谢物的分析给出最终的、整体的结果,这是其在健康评估、疾病诊断、疗效评价等方面巨大应用前景的优势所在[3,4]。随着这些组学研究的深入,科学家们逐渐认识到:基因组的变化不一定能够得到表达,从而并不对系统产生影响。某些蛋白的浓度会由于外部条件的变化而升高,但由于这个蛋白可能不具备活性,从而也不对系统产生影响。同时,由于基因或蛋白的功能补偿作用,某个基因或蛋白的缺失会由于其他基因或蛋白的存在而得到补偿,最后反应的净结果为零。而小分子的产生和代谢才是这一系列事件的最终结果,它能够更准确地反映生物体系的状态[5]。

代谢组学关注的对象是分子量1 000以下的小分子化合物。根据研究的对象和目的不同,Oliver[6]将对生物体系的代谢产物分析分为4个层次:①代谢物靶标分析(Metabolite target analysis):某个或某几个特定组分的分析;②代谢轮廓分析(Metabolic profiling):少数预设的一些代谢产物的定量分析。如某一类结构、性质相关的化合物(氨基酸、有机酸等)或某一代谢途径的所有中间产物或多几条代谢途径的标志性组分;③代谢组学(Metabolomics):限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量;④代谢物指纹分析(Metabolic fingerprinting):不分离鉴定具体单一组分,而是对样品进行快速分类(如表型的快速鉴定)。

完整的代谢组学流程包括样品的采集、预处理、数据的采集和数据的分析及解释。通过测定生物体液、细胞提取物、细胞培养液或组织中代谢物的变化,参照正常代谢信息,将所得的大量数据用生物信息学、化学信息学、统计学方法进行比较分析,发现其内在的联系,为临床提供客观的信息。检测样本常用的是血浆、尿液、唾液。其研究平台主要由分析技术平台和数据分析平台构成。代谢组学力求分析生物体系(如体液和细胞)中所有代谢产物,所以整个过程中都强调尽可能地保留和反映总的代谢产物的信息[7]。支撑起代谢组学的技术方法包括:一维核磁共振(1H NM R Spectroscopy,1H-NM R)、气相层析质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相层析质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、傅立叶层析质谱(Fourier T ransform mass spectrometry,FTMS)、高效液相质谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、电化学阵列(electrochemical array,EC-array)。运用偏最小二乘法,判别分析法(PLS-DA)[8]或人工神经网络[9]等方法建立数据模型,就可以对这些来自不同样本的生物学信息进行预测分析。

2 代谢组学在心血管疾病中的研究进展

有研究应用1H-NMR技术以36例严重心血管疾病患者和30例心血管动脉硬化患者的血清和血浆为研究对象进行了代谢组学分析,结合主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)、SIMCA(Soft Independent Modelling of Class Analogy)、偏最小乘方分析(PLS-Discriminant Analysis,PLS-DA)、OSCPLS等模式识别技术实现了对心血管疾病及其严重程度的判别,得到了＞90%的灵敏度及专一性。Brindle等[10]还运用NM R对不同血压水平人群进行血清代谢组学检测后发现,正常人同血压偏高一级高血压患者存在代谢组学差异,充分证实了高血压的发生、发展有着其内在的代谢组学本质,代谢组学能够即时、灵敏表征高血压患者的整体功能状态变化。

祖国医学理论体系的基本特点是整体观念和辨证论治。在整体观念的指导下,中医学认为人体是一个有机的整体,各个组织、器官、系统的功能是相互联系、相互影响的。辨证论治是中医的精髓,在这里的“证”即指证候,是一个综合征,是个体对内外环境的整体性反应状态,证候具有复杂性、模糊性、多样性和变化性等特点。代谢组学采用的是“自上而下”式的研究方法,是对代谢的终端产物进行多元化综合分析,从整体上展示生物体内在的变化状态,避免了以往采用单一指标或少数几个指标研究某种病理和生理变化[11],这与中医学的整体观念十分吻合,从而为中医证候研究提供崭新的技术平台。代谢组学在心血管疾病证候标准化研究中已经取得了一些进展。

刘卫红等[12]运用高脂饲料喂饲法复制大鼠高脂血症模型,通过动态观察高脂血症、动脉粥样硬化发病过程中的代谢产物,探讨高脂血症、动脉粥样硬化痰证、瘀证演进过程中的生命标志物,解释痰瘀证候的动态演变、时相特点和由痰致瘀的条件。从1H NMR图谱及模式识别分析发现:①正常对照组与模型组之间存在代谢产物谱的证显著差异,随着造模时间延长,模型组不同时间点样本之间能较好地分开,说明血浆代谢组学分析较好地反映疾病证候的动态演变;②在1H NMR图谱中可以发现乳酸、乙酸、丙氨酸、葡萄糖、氧化三甲胺、O-乙酰糖蛋白、胆碱、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白(LDL/HDL)、不饱和脂肪酸等的谱峰强度改变较为明显。乳酸是体内三羧酸循环的中间产物,其代谢异常是能量代谢紊乱的标志;丙氨酸的代谢异常与肾小球滤过和回收功能有关;乙酸代谢异常则是肝功能损伤的标志;胆碱是一种维生素类化合物,它对细胞膜完整性及脂类消化运输发挥重要作用。说明高脂血症大鼠体内不仅脂肪和能量代谢紊乱,并存在肝肾功能的损害。③随着造模时间的延长,由2周的VLDL升高,经4周时各种脂肪酸和血糖升高,至8周时以 N-乙酰糖蛋白、酮体、肌酐以及乳酸升高为主。这些结果表明,高脂血症前期以脂质代谢紊乱为特点,及高脂血症痰浊的生化物质基础,随着病程进展,乙酰糖蛋白,尤其是O-乙酰糖蛋白的出现,说明凝血机制出现异常。因为参与血液凝固过程的纤维蛋白原、凝血酶原和集中凝血因子都是糖蛋白。因此,乙酰糖蛋白谱峰的改变可能是高脂血症大鼠模型血瘀的早期生物标志物。

朱萱萱等[13]选取住院并经冠脉动脉造影确诊为冠心病的患者90例,辨证为痰阻心脉、气阴两虚、气虚血瘀及气滞血瘀4型,采用基于气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF-MS)的代谢组学技术分析冠心病不同证型间的血清代谢物变化规律。结果显示,冠心病患者与健康人、冠心病患者之间在代谢组学方面存在差异。男性的score plot图中,健康对照组、气虚血瘀证和痰阻心脉证相应集中在3个不同区域,完全没有重叠,区分度很高。女性的score plot图中,健康对照组、气虚血瘀证、痰阻心脉证和气阴两虚证相应集中在4个不同区域,基本没有重叠,区分度也很高。提示代谢组学方法可能成为冠心病的病因病机以及中医辨证分型的新研究手段。

简维雄等[14]通过对心血瘀阻证大鼠血浆的代谢产物、血液流变学指标的变化,以及养心通脉方干预后指标改变的分析识别,探讨大鼠心血瘀阻证血浆代谢产物的“组装”规律。将 32只大鼠分为模型组、空白组、养心通脉方组、假手术组4组,运用GC-MS法进行血浆代谢组学研究,鉴定各组共有峰,通过对不同组之间代谢产物含量的变化进行PCA,同时检测分析各组血液流变学指标。结果显示,模型组全血黏度、血浆黏度指标高于其余3组;大鼠血浆样品散点图显示模型组与空白组、养心通脉方组、假手术组完全分离。因子载荷图表明乳酸、丙氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苹果酸、硬脂酸、花生四烯酸等代谢物质含量明显增高,果糖含量明显降低。养心通脉方干预后代谢物含量、血液流变学指标均不同程度的回调。因此可以认为,发生改变的乳酸、丙氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苹果酸、硬脂酸、花生四烯酸、果糖等8种代谢物与反映“血瘀”病理的血液流变学指标的改变具有一致性,有可能作为心血瘀阻证代谢性生物标志物。

严蓓等[15]建立了心血瘀阻和气阴两虚证心肌缺血大鼠模型,基于GC/TOF-MS检测技术的代谢组学方法,分析血浆中的内源性小分子代谢物,发现两种中医证型和正常大鼠之间代谢图谱存在明显差异,数据处理和模式识别后各组可被清晰地区分,与正常大鼠相比,模型大鼠血浆中羟脯氨酸、苏糖酸、谷氨酰胺、柠檬酸等化合物的相对含量发生了显著变化。两种证型大鼠间血浆中缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、呋喃半乳糖、肌醇等化合物的相对含量存在统计学意义,这些化合物是区分这两种中医证型的潜在生物标志物。研究结果提示,这两种证型与能量代谢异常、氧化应激反应、氨基酸代谢异常等体内变化密切相关,此法为探索这两种基于心肌缺血的中医证的科学内涵、病理机制及科学“辨证”提供了研究基础。

3 结 论

代谢组学具有巨大的应用潜力和科学价值,但目前也存在着明显的不足。对某一物种、某个组织或其细胞中所有代谢途径中的所有代谢产物同时进行全面高通量的定性和定量分析,在理论上行得通。但目前,没有任何一个分析技术能够同时对代谢组中的所有化合物进行分析,只能通过选择性地提取结合各种分析技术的并行分析来解决这个问题。代谢组学分析产生出海量的数据,但目前尚无有效数据分析手段能够将得到的全部信息进行分析和解释。为了解决这些问题,需要从以下几个方面进行努力:建立更加快速和有效地代谢产物浓度分析方法;建立色谱、电泳和质谱原始数据处理的方法;建立代谢组学数据的数据库;建立代谢产物数据的标准。如何把代谢组学数据与转录组学、蛋白质组学、遗传学、酶学、代谢途径和表现型分析的数据整合在一起,并给出生物学功能的解释将是最大的挑战。因此,有必要对研究对象从各个技术平台平行研究,并进行整合,从而对疾病获得全面的了解。随着代谢组学技术的不断进步,其在心血管疾病领域的应用必将更加广泛,进一步提高心血管疾病的诊治水平,提高人们的生活质量,延长寿命,减少社会医疗资源的大量浪费,促进社会经济和谐发展。

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