脂肪酶催化红花油水解的选择性研究

冯瑞军

(新疆轻工职业技术学院， 新疆 乌鲁木齐 830021)

0 引 言

酶催化反应的选择性有很好的实用价值，近年来日益受到人们的重视.近年来对酶的选择性的研究主要集中在立体选择性及对映体的拆分上[1,2]，而对水解中酶的位置选择性和脂肪酸类型选择性的研究鲜有报道.本文所用脂肪酶Lipase LVK来源于黑曲霉，文献对其专一性的报道并不一致.另外，脂肪酶Lipase F-AP15是一种sn-1,3位选择性脂肪酶，其选择性水平有待研究.本文对脂肪酶Lipase LVK、Lipase AY 30G 以及Lipase F-AP15的位置选择性、脂肪酸选择性进行了研究测试.

1 材料和方法

1.1 主要原料及试剂

脂肪酶Lipase LVK(粗酶粉，深圳市绿微康生物工程有限公司)，来源于黑曲霉，活力为25 000 U/g.

Lipase AY 30G (Amano Enzyme INC NAGOYA, Japan,天野公司惠赠)，来源于假丝酵母，活力为30 000 U/g.

Lipase F-AP15 (Amano Enzyme INC NAGOYA, Japan，天野公司惠赠)，来源于根霉，其活力为150 000 U/g.

红花油，产地：伊犁，碘值[4]：146.2 mg/g，其脂肪酸含量气质色谱分析结果见表1.

表1 红花油中脂肪酸含量分析

0.1 mol/L氢氧化钾/乙醇标准溶液，0.5 mol/L氢氧化钾/乙醇标准溶液.

0.1 mol/L硫代硫酸钠标准溶液，0.1 mol/L氯化碘冰醋酸标准溶液重铬酸钾(基准物)，薄层层析硅胶G.

1.2 仪器及设备

ZD-8802型摇床(太仓市科教器材厂)；Orion 828型酸度计(美国奥立龙).高速组织捣碎机；微量注射器.

1.3 分离及检测方法

1.3.1 水解产物中脂肪酸与混合酯的分离方法

向洗去酶粉后的水解产物中加入酚酞指示剂，加入0.5 mol/L KOH/乙醇至溶液呈深红色, KOH优先与脂肪酸(FFA)形成水溶性皂[3],加入适量水﹑正己烷及适量乙醇，溶液中脂肪酸皂与混合酯分离；上层溶液蒸去正己烷后得到混合酯；下层溶液(脂肪酸皂的水溶液)中加入6 mol/L HCl，调节至pH为2，用正己烷提取上层脂肪酸，蒸去正己烷后，得到游离脂肪酸.

1.3.2 单甘酯含量的测定

由于所用红花油的不饱和度较高，因此直接用常规方法[4]测定产物中的单甘酯含量时误差较大，实验中加入足量的氯化碘(ICl)-冰乙酸溶液，使其不饱和键转化为饱和键，以消除不饱和键的干扰,从而适用于不饱和酯的测定.

精称两份去脂肪酸的酯类混合物0.05～0.06 g，两份质量相同(否则需作韦氏液空白并对体积折算),分别置于具塞三角瓶中,两瓶中都加入氯仿及0.1 mol/L ICl-冰乙酸溶液各10 mL,摇匀置暗处反应50 min后,其中一份加入KI溶液及去离子水,用0.1 mol/L Na2S2O3滴定至终点(与测碘值[5]相同)，滴定量为V1；另一份加入0.07 mL 56%高氯酸溶液及25 mL 0.3%高碘酸-冰乙酸溶液,35 min后,同上述滴定至终点, 滴定量计为V2；同时作空白，滴定量计为V0，按下式计算单甘酯含量:

式中,V=V2-V1,m为称取样品质量,c为Na2S2O3摩尔浓度,354.56为单亚油酸甘油酯的相对分子质量.

1.3.3 脂肪酸位置选择性的测定

自制20 cm×20 cm硅胶G薄板，硅胶厚度0.2～0.5 mm.将水解产物中分去游离脂肪酸，混合酯溶于乙醚，在薄板上展开，展开剂为V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=15∶1，饱和碘蒸气显色.测量单酯、二酯、三酯显色斑点面积，比较3种酯的相对含量作为参考.

通过测定产物中3种酯的含量，可初步判断脂肪酶是否有位置选择性.

1.3.4 脂肪酸种类选择性的测定

在一定水解率下，分离水解产物中的游离脂肪酸和混合酯，分别测定脂肪酸和混合酯的碘值，可判定脂肪酶对脂肪酸类型有无选择性.

2 结果与讨论

2.1 脂肪酸位置选择性

表2 脂肪酸位置选择性分析结果

以3种酶水解红花油，水解条件为35 ℃,200 r/min，m(油):m(水)=1，以3种水解率的产物为样品, 薄层分析单酯(MG)﹑二甘酯(DG)﹑三甘酯(TG)的含量,分析结果见表2.单甘酯含量测定结果见表3.

表3 单甘酯含量测定结果

对比表3中单甘酯含量与表2中采用薄层层析法所得单甘酯含量，结果具有一致性，说明结果可靠.可以看出，脂肪酶Lipase LVK和 Lipase AY 30G在水解初期(水解率10%左右)，水解产物中即开始出现单甘酯；在水解率达33%左右时，二甘酯含量比例并不高，在水解率达66%左右时，单甘酯含量亦未占优势，且体系中仍有未水解的三甘酯存在，这表明脂肪酶Lipase LVK和 Lipase AY 30G没有酯键位置选择性.而脂肪酶Lipase F-AP15在实验条件下显示了一定程度的位置选择性：水解率为10%左右时，体系中单甘酯含量很少，水解率为33%左右时，体系中二甘酯含量较高，水解率为66%左右时，体系中单甘酯含量占较大优势.

表4 脂肪酸种类选择性分析

2.2 脂肪酸种类选择性

红花油中饱和脂肪酸的质量分数为7.71%，红花油中除亚油酸外的脂肪酸的质量分数为20.11%，红花油中亚油酸的质量分数在79.89%，选择水解率为8%﹑20%﹑80%的水解样品进行分析测试,容易判断脂肪酶是否对脂肪酸种类具有选择性.以3种酶水解红花油，水解条件为35 ℃,200 r/min，m(油)∶m(水)=1.以3种典型水解率(即8%、20%、80%)的产物为样品,将水解产物中的游离脂肪酸与混合酯分离后，分别测定酸值(AV)和碘值(IV). 水解条件及水解率见表4，游离脂肪酸及混合酯的酸值及碘值测定结果见表5.

表5 脂肪酸种类选择性测定结果

从测试结果可以看出，分离出的酸和酯的纯度较高(97%以上)，说明游离脂肪酸与混合酯的分离程度较高；在几种典型水解率下，酸与酯类的碘值差别很小，且都接近红花油的碘值，说明这几种酶在水解油脂时对饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸的水解能力相同，不具有脂肪酸选择性.

3 结 论

本文对脂肪酶脂肪酶Lipase LVK、Lipase AY 30G、Lipase F-AP15的位置选择性和脂肪酸选择性进行了研究，结果表明：脂肪酶Lipase LVK﹑Lipase AY 30G没有位置选择性和脂肪酸选择性，而 Lipase F-AP15无脂肪酸选择性，但有一定的位置选择性.

参考文献

[1] 辛嘉英，赵永杰，石彦国，等.水饱和离子液体中脂肪酶催化萘普生甲酯对映选择性水解[J].催化学报，2005，26(2)：118-122.

[2] 杜 伟，李 琼.有机相脂肪酶催化酮基布洛芬的立体选择性酯化[J].微生物学通报，2000，27(6)：429-432.

[3] V.Tatum , C.K. Chow.Lipase catalyzed alcoholysis with superecritieal carbon dioxide extraction influenee of flow rate[J].Food Sci Technol,1992,(53):337.

[4] GB/T 5532-1995.Vegetable Oils-Determination of Iodine Value(植物油碘价测定)[S],1995.

[5] 黄健花，刘亚轩，宋志华，等.无溶剂体系脂肪酶催化大豆油水解反应动力学—界面面积与反应初速度[J].中国油脂，2009,(12):39-43.

[6] 王 英，周剑忠，黄开红，等.固定化脂肪酶催化大豆油合成生物柴油生产的研究[J].江苏农业科学，2007,(5)：211-214.

[7] 张 敏，扬金明，宋 洁，等.脂肪酶在催化合成脂肪族聚酯中的应用[J].塑料,2009,(2)：62-64.