黄芩苷酶解影响因素及其动力学参数的研究

施春阳， 齐香君， 端木艳荣， 钱卫东

(1.陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西博森生物制药股份集团有限公司， 陕西 西安 710118)

0 前 言

黄芩苷和黄芩素是黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)中的主要有效成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤及止血安胎等药理作用[1-4].黄芩苷在人体内吸收差、转化率低，药代动力学研究[5]表明：其口服制剂需经胃肠道菌丛酶解或肝微粒体转化为黄芩素后被吸收.黄芩素的生物利用度和药理活性均高于黄芩苷，但在黄芩中含量低、易被氧和碱破坏、生产成本高，从而使其应用受到了很大的限制.近几年研究[6,7]显示：利用β-葡萄糖苷酶酶解黄芩苷制备黄芩素应是可行的方法，可以有效扩大黄芩素的来源.因此，笔者对黄芩苷酶解的影响因素进行了考察，并对酶解过程的动力学进行了初步探索.

1 仪器与材料

752 紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；760CRT 双光束紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司； CS501-SP 数显恒温器，重庆四达试验仪器有限公司.

黄芩苷：自制，纯度>95 %(HLPC测定)；β-葡萄糖苷酶：自制酶液(酶活830 U)；黄芩素：纯度>98 %(HLPC测定)；其他实验试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 酶液制备及酶活测定

将1 mL酶液1 min内酶解底物生成1μg葡萄糖，定义为1个酶活单位(U).酶液由黑曲霉固体培养，经pH 4.8缓冲溶液提取、离心，取上清液即得[8,9]，经DNS法[10]测定酶活为835 U，保存一周复测为830 U，即短时间保存酶活稳定.

2.2 黄芩苷酶解率测定方法

2.2.1 酶解样品液的制备

精密称取0.100 g黄芩苷于三角瓶中，加适量pH 4.8缓冲溶液超声碎至细粉，加入一定量的酶液，立即保温搅拌至规定的时间，即得.

2.2.2 黄芩素标准曲线的建立

精密称取恒重的黄芩素10.0 mg，氯仿溶解并定容至100 mL，得黄芩素标准液.分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL标准液于10 mL容量瓶，氯仿定容.以氯仿为空白，274 nm处测吸光度A.以C(黄芩素浓度，μg·mL-1)对A进行线性回归，标准曲线方程为：A=0.089 172 6C+0.001 666 7，r=0.999 882，说明黄芩素在2～14 μg·mL-1内线性关系良好.

2.2.3 酶解率的测定

测定时，用氯仿回流提取酶解样品液数次，合并氯仿并补至250 mL，稀释40倍后于274 nm处测吸光度A，根据黄芩素标准曲线及下式计算酶解率：

2.3 酶解反应速率的测定

在酶解一定时间的样品液中加入适量氯仿回流，终止酶解反应，按“2.2.3”测定吸光度，并按黄芩素标准曲线和下式计算酶解反应速率rs：

以上两式中：C-黄芩素浓度，μg·mL-1；rs-酶解反应速率，g·L-1·min-1；m-黄芩苷质量，g；Mr1-黄芩素相对分子质量；Mr2-黄芩苷相对分子质量.

2.4 不同因素对酶解率影响的考察

2.4.1 pH对酶解率的影响

每份称黄芩苷0.100 g，加10 mL酶液，分别调pH至4.0、4.3、4.6、4.9和5.2，于55 ℃酶解1.5 h，按“2.2.3”测定，结果见图1.由图1可知，pH对酶解率影响显著，酶解率随pH的增大先增加后减少，且黄芩苷酶解最适pH约为4.6.

图1 pH对酶解率的影响趋势 图2 酶解温度对酶解率的影响趋势

2.4.2 温度对酶解率的影响

每份称黄芩苷0.100 g，加10 mL酶液，分别在40、48、55、63和70 ℃下酶解1.5 h，按“2.2.3”测定，结果见图2.由图2可知，温度对酶解率影响明显，酶解率随温度的升高先增强后减弱，且黄芩苷酶解最适温度约为55 ℃.

2.4.3 加酶量对酶解率的影响

每份称黄芩苷0.100 g，分别加0、5、10、15、20、35和40 mL酶液， 于55 ℃酶解1.5 h，按“2.2.3”测定，结果见图3.由图3可知，在较低的酶浓度下，酶解率随酶量的增加几乎呈线性增长.当加酶量达20 mL时，增长趋于缓慢并最终在一个水平上震荡，故最适加酶量约为20 mL.

图3 加酶量对酶解率的影响趋势 图4 酶解时间对酶解率的影响趋势

2.4.4 酶解时间对酶解率的影响

每份称黄芩苷0.100 g，加10 mL酶液，于55 ℃分别酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5和5.0 h，按“2.2.3”测定，结果见图4.由图4可知，1.5 h前酶解率随时间几乎呈线性增长，符合一般酶解的特点，1.5至2.0 h酶解率增加趋于缓慢，后又急速降低，并在2.5 h后平稳并小范围波动.综合考虑，最适酶解时间约为1.5 h.

2.5 酶解动力学特征参数的测定

称黄芩苷0.040、0.080、0.120、0.160、0.200、0.240和0.280 g，各加10 mL酶液，于55 ℃酶解10 min，按“2.3”测定rs，并计算cs/rs值，结果见表1.

表1 不同初始底物浓度时的rs 和cs/rs值

酶解反应动力学最重要的两个特征参数是米氏常数Km和最大反应速率rmax，可以根据表1中数据由Hanes-Woolf法[11]求得：最大反应速率rmax为0.216 g·L-1·min-1，米氏常数Km为5.03 g·L-1.

3 结 论

通过考察不同因素对黄芩苷酶解反应酶解率的影响，获得了较好的酶解条件：黄芩苷∶酶液为0.1 g∶20 mL、pH 4.6、55 ℃搅拌酶解1.5 h，酶解率可达70%左右.通过正交试验设计应可进一步优化酶解条件，提高酶解反应的酶解率，使黄芩苷酶解制备黄芩素更具实际意义，为其大量生产提供可靠的依据.

试验得到最大反应速率rmax为0.216 g·L-1·min-1，米氏常数Km为5.03 g·L-1，可见Km非常小，说明β-葡萄糖苷酶与底物黄芩苷亲和能力较强，专一性好，酶解反应可行且较容易进行.

参考文献

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