一种检测水质毒性的细菌发光传感器的研究

李书钺

(林同棪国际工程咨询(中国)有限公司， 重庆 401121)

0 引 言

随着现代经济的快速发展，随之也引发了一些负面影响，其中环境问题尤为严重，因此对污染物的毒性鉴定显得十分重要.就此问题，分析工作者研究采用各种生物方法来检测水质毒性，包括微生物、藻、底栖软体动物、浮游生物、鱼等，其中发光细菌因其独特的生理发光特性以及与现代光电检测手段完美结合的特点而得到了人们广泛的关注.Hastings最先提出了发光细菌的发光机制，发光细菌在20世纪30年代首先用于快速评价药物的毒性作用.1978年美国Beckman仪器公司研制了生物发光光度计，即Microtox系统.目前，许多国家如加拿大、法国、意大利、美国已将发光细菌方法作为标准的毒性测试方法.采用发光细菌作为毒性测试的指标生物的生物毒性检测仪，以其结果可靠、操作方法简便和经济耗费低等优点已经成为水质毒性检测研究的主要方向[1-3]，我国也于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法( GB/T 15441-1995)[4].但是，由于受到发光细菌生长周期的限制，使得现场检测与实际水质毒性存在较大的人为误差，再者由于很多仪器敏感元件需要与毒性物质接触，从而大大缩短了仪器使用寿命.本研究采用光纤传导，以明亮发光杆菌为指示生物，将发光细菌制成生物膜组件，这样可以使检测系统与分析系统相分开，不仅能够延长仪器的使用寿命，还能够实现急性毒性的连续检测，大大方便了发光细菌传感器在现场的应用，也为研制在线检测传感器奠定了基础.

1 发光细菌传感器的原理及结构

1.1 发光细菌传感器的原理

发光细菌通过其正常新陈代谢产生发光现象，在条件一定的情况下，发光较为稳定，并且在有外在毒性物质存在的情况下，发光变化较为显著.其代谢反应过程可以简要概括为[5]：

FMNH2+RCHO→FMN+RCOOH+H2O+hv

该反应是在发光细菌细胞内由细菌荧光酶素催化，黄素单核苷酸(FMNH2)、长链脂肪酸(RCHO)、氧气(O2)发生反应，产生波长约为480 nm的蓝绿光.当发光细菌与外来毒性物质接触一段时间后，其发光强度有明显的变化.通常情况下，发光细菌的发光强度与毒性物质的毒性大小呈负相关的关系.Thomulka 认为,外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 外在毒物直接抑制发光反应酶活性，从而影响代谢反应；(2) 外在毒物通过抑制细胞内与发光反应有关的其他代谢过程(如细胞呼吸等)间接影响发光代谢反应[6].基于以上原理，利用发光细菌的发光强度与毒性物质的毒性大小呈负相关的关系，可以研制检测水质毒性的发光细菌传感器.

1.2 发光细菌传感器系统结构概述

本设计将发光细菌固定成便于携带、安装与保存的生物膜组件，使其与经过预处理的外来毒物在反应室内反应15 min，产生光信号变化；微弱的发光细菌光信号通过多模光纤传输至高灵敏度的光电转换器，本研究采用光电倍增管R105(北京滨松电子)实现光信号与电信号的转换；然后通过高精度放大器件OP124制成放大电路将微弱电信号放大到0～5 V，OP124运算放大器属于高精度、低温漂、电流噪声低类型的放大器，是电流电压转换核心器件；本设计采用了巴特沃斯低通滤波器，截止频率为30 kHz,以消除外界信号的干扰.最后通过数据采集卡对信号进行采集、处理以及进行受试物的毒性评估[7].如图1所示.

图1 发光细菌传感器系统组成

本设计以明亮发光杆菌为指示生物，其发射光为蓝绿色荧光,光谱范围420～670 nm ，波峰位置λmax在475～485 nm 左右.首先，将明亮发光杆菌固定成直径为2 cm的生物膜组件，将其放入暗盒中，生物膜组件与光纤之间的距离为2 mm，在闭光的情况下通过检测系统测定发光强度的变化值.采用剂量-效应实验方法对毒性进行评估,发光细菌组件与受试物反应15 min后，发光量减弱到50%时的受试物浓度(50%)，即为EC50值.实际检测通过相对发光量来反映污染物的急性毒性：

RLU=Vp/Vu×100%

式中：RLU为相对发光度；Vp加受试物细菌发光强度；Vu对照发光强度.

2 实验方法

2.1 仪器

R105光电倍增管(北京滨松电子有限公司)、WLQ蠕动泵、暗盒式流通池、光纤、WC109-05恒温器、RS9901生物发光仪(上海容圣生物电子公司)、VC9807胜利数字万用表.

2.2 菌种及培养基

明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphorreum)购自南京土壤所.

ASW培养基(W/V):胰蛋白胨(0.5%),酵母浸出汁(0.5%),氯化钠(3%),磷酸氢二钠(0.5%),磷酸二氢钾(0.1%),甘油(0.3%),琼脂粉(1.5%),pH 7.0.

2.3 受试物

Pb(NO3)2、CdCl2·3H2O、K2Cr2O7、Hg(NO3)2、CuSO4·5H2O,所用试剂均为分析纯.

2.4 生物膜组件的构建

首先将细菌进行斜面培养，从斜面接菌种于ASW培养液中, 20 ℃恒温, 200 r/min摇床培养15 h, 使菌数达到108～109个/mL.首先采用尼龙材质网制成直径为2 cm的生物膜组件骨架，然后采用海藻酸钠包埋法制备生物膜组件[8]，将30 g/L的海藻酸钠溶液与等体积的108个/ mL的菌液缓慢混合在一起，混合均匀后，用注射器吸取0.8 mL的混合物均匀注入到尼龙网上面，固定成直径为2 cm的均匀圆片[9]；将圆片浸在0.3 mg/L的CaCl2溶液中约20 min，使其充分固定.此生物膜组件限一次使用，保存在4 ℃条件下，使用时采用新鲜培养基复苏，复苏时间为20 min.

图2 反应室示意图

2.5 发光细菌传感器的组装

构建生物传感器反应室，如图2所示.将制备好的生物膜组件插入传感器预留孔中构成反应室，生物膜组件与蠕动泵、光纤、暗盒、计算机控制系统构成发光细菌传感器.此系统设计首先采用固定化技术将明亮发光杆菌固定成生物膜圆片，并将生物膜圆片插入传感器反应室预留孔中，通过光纤传输变化的微弱光信号，光纤距生物膜间距为3 mm.采用高灵敏度光电转化器件光电倍增管和高精度运算放大器将电流信号转化为电压信号并放大.设计滤波电路，截止频率为30 kHz，以减少外界信号对微弱信号的干扰.最后，通过计算机控制系统将电信号转化为模拟信号并运算输出.传感器结构示意图如图3所示，用蠕动泵吸取受试物，生物组件与受试物接触15 min后光电检测器件即开始检测.

图3 发光细菌传感器示意图

3 结果与讨论

3.1 检测条件的选择

3.1.1 pH与温度

在20 ℃条件下，反应池分别通入pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的未加受试物的底液，测得的发光变化值见表1.

由表1可见，受试物的pH值对毒性测定影响较大，过酸或过碱都会影响细菌的发光，这主要是由于过酸或过碱影响了发光细菌的代谢过程，使发光细菌不能正常代谢，导致发光量下降甚至发光猝灭.pH值在7.0左右时发光细菌发光量较为稳定，故设定测量最适pH值为7.0.

在pH值为7.0的条件下，分别通入温度为10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃的3% NaCl溶液，测得的发光变化值见表2.

表1 不同pH底液时细菌的发光强度

表2 不同温度底液时细菌发光强度

表3 不同反应时间细菌发光强度

由表2可见，受试物的温度对毒性测定影响较大，温度过高或过低都会影响细菌的发光，这主要是由于温度过高或过低都会影响发光细菌反应酶的活性，使发光细菌不能正常代谢，导致发光量下降甚至发光猝灭.温度值在20 ℃时发光细菌发光量较为稳定，故设定测量最适温度值为20 ℃.

3.1.2 检测时间的确定

在上述确定条件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)为受试物，测定发光细菌发光强度随时间的变化，结果见表3.

如表3所示，发光细菌发光量变化经历了先下降后平稳的过程，在15 min时降为初始值的一半，相对偏差为2%.在5 min后下降变得缓慢，为了兼顾检测速度与灵敏度，并与标准检测方法做比较[10]，我们将检测时间定为15 min，相对偏差为2%.

3.1.3 底液流速的确定

在上述确定条件下，以0.15 mg/L Hg(Ⅱ)为受试物，测定发光细菌发光强度随时间的变化，结果见表4.

表4 不同底液流速细菌的发光强度

由表4可见，底液流速过高或过低都不利于发光细菌毒性检测，底液流速过低，发光细菌所感受到的毒性物量不足；流速过高，毒性物质对发光细菌的毒性过大，较难真实反应细菌发光量受毒性抑制的情况，故设定底液流速为3 mL/min.

3.2 重金属污染物毒性测定

在上述确定实验条件下对Hg2+、 Cd2+、 Cr6+、Pb2+、 Cu2+的急性毒性进行了研究，将受试物用3%的NaCl溶液配成5个浓度梯度，如表5所示，搅拌均匀.以3% NaCl溶液做空白对照,每个浓度梯度设3个平行.取培养15 h后的菌液制成发光细菌生物膜组件，并用蠕动泵将受试物通入进水通道，用生物毒性测试仪测定发光强度.用直线内插法求出相对发光量为50%时所对应的毒性物质浓度，即为该毒物对发光细菌半数发光抑制浓度(EC50)[11].每个浓度梯度设3个平行实验，标准偏差低于10%.

表5 受试物测试浓度

表6 受试物线形方程及相关系数

利用SPSS13.0软件进行数据处理.

以离子浓度计算Pb2+、Cr6+、Cd2+、Hg2+、Cu2+对发光细菌的EC50,结果分别为16.55 mg/L、4.6 mg/L、10.53 mg/L、0.15 mg/L、19.06 mg/L，对发光菌的急性毒性从大至小依次为Hg2+> Cd2+> Cr6+> Pb2+> Cu2+.实验结果采用线形回归分析方法[12]，结果如表6所示.

如表6所示，重金属对发光细菌毒性的大小顺序为Hg2+> Cr6+> Cd2+> Pb2+>Cu2+，毒性的大小顺序与采用国标推荐的方法测得的结果有很好的一致性.经分析，有可能是发光细菌的荧光酶受到金属离子的负作用后抑制了发光细菌的正常代谢作用，导致发光量下降[13].

表7 传感器系统稳定性的测定

3.3 传感器系统稳定性的测定

选择检测条件pH值为7.0、温度为20 ℃、测定时间为15 min、底液流速为3 mL/min.以Hg2+、 Cd2+为受试物，受试浓度分别为0.15 mg/L、10.53 mg/L，测定其相对发光量.设5个平行试验，分别编号1，2，3，4，5组.

如表7所示，Hg2+、 Cd2+在pH值为7.0、温度为20 ℃、测定时间为15 min、底液流速为3 mL/min条件下，以浓度分别为0.15 mg/L、10.53 mg/L测定其发光量在0.5左右，标准偏差分别为4.41%、6.11%，具有较好稳定性，说明以上测量数据具有较高的可信度.

4 结 论

(1)该仪器符合国家质量技术监督局、国家环境保护总局颁布的《GB/T1544121995 水质急性毒性的测定:发光细菌法》的测试方法，适合多种有毒化合物废水生物毒性的测定，可广泛应用于水质急性毒性的研究.

(2)该仪器采用了便于携带、安装和保存的生物膜组件，大大提高了现场检测的效率，为研究在线水质急性毒性检测系统奠定了基础.

(3)该仪器设计检测与分析系统分开，延长了仪器的使用寿命，文中较为具体的分析了其使用条件，能够准确的检测水质毒性.

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