钙蛋白酶系统与肉嫩度调控的研究进展

王广银

(1.德州学院农学系,山东 德州 253023;2.德州市兔业工程技术研究中心,山东 德州 253023）

肉嫩度是衡量肉质优劣的重要指标之一。近年来,人们试图通过各种方法来改善肉质的嫩度,以满足消费者的需求,但通过非遗传因素来提高肉的嫩度成效不大[1],随着分子生物技术的发展,标记辅助选择为解决这一问题提供了新的思路。研究表明,钙蛋白酶是影响宰后肉质嫩度最重要的候选基因,在肌肉纤维宰后嫩化中扮演着重要角色,控制着肌纤维蛋白的降解,是肌肉蛋白降解的限速步骤[2],因而在肉的嫩化中起着重要作用。本文简要综述钙蛋白酶系统的结构、功能、活性调节及其在肉嫩化中的作用机理等研究进展。

1 钙蛋白酶系统的结构和功能

钙蛋白酶系统是高度可调的、复杂的蛋白质水解酶系统,主要包括依赖于Ca2+的钙蛋白酶、钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶激活蛋白,以及其活性表现为钙非依赖性的骨骼肌特异性钙蛋白酶。

1.1 钙蛋白酶 钙蛋白酶是细胞内钙依赖性中性半胱氨酸内肽酶,主要存在于肌纤维Z盘附近和肌质网膜上。根据钙蛋白酶表现半最高活性所需的Ca2+浓度的不同,可以将其分为钙蛋白酶Ⅰ(μ-calpain）和钙蛋白酶Ⅱ(m-calpain）[3],两者都由2个亚基组成,其中30 kD小亚基在两种钙蛋白酶中是相同的,由DⅤ和DⅥ两个结构域组成,两结构域之间由一段富含脯氨酸的序列连接,为同一基因的产物,而80 kD大亚基是由4个结构域组成,是不同基因的产物[4]。大亚基的DⅠ在μ-calpain活化前或活化过程中自体水解发生自溶,是酶原活化时被加工的区域;DⅡ是表现水解活性的关键部位;DⅢ起活性调节作用;DⅣ是钙离子的结合部位[5]。

在宰后肉类成熟过程中,μ-calpain通过降解α-肌动素、Z-nin蛋白,而m-calpain通过降解肌间线蛋白、联结蛋白、半肌动蛋白、肌钙蛋白 T和 I、原肌球蛋白、C-蛋白、M-蛋白来弱化肌纤维结构来提高肉的嫩度,但在成熟的过程中主要是μ-calpain,而不是m-calpain参与了肉的嫩化[6]。

1.2 钙蛋白酶抑制蛋白 钙蛋白酶抑制蛋白是细胞内专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质,它可以识别钙蛋白酶与Ca2+结合引起的构象变化并与之特异性结合。钙蛋白酶抑制蛋白含有5个结构域,N端第一个结构域称L结构域,其功能目前还不太清楚,第2个到第5个结构域是4个相似的重复单位,每个重复单位含有A、B、C 3个保守区。钙蛋白酶抑制蛋白主要是防止钙蛋白酶被过度激活产生一种潜在而剧烈的破坏物,它调控着钙蛋白酶的活性,是通过抑制钙蛋白酶的自溶而发挥作用[7]。

1.3 钙蛋白酶激活蛋白 钙蛋白酶激活蛋白是钙蛋白酶活性的直接调节者,它可以增强钙蛋白酶在生理条件下对Ca2+的亲和性,并与钙蛋白酶结合而起活化作用,促进钙蛋白酶活性的发挥[8]。目前发现的钙蛋白酶激活蛋白有 UK 114和ACBP(酰基辅酶A结合蛋白）两种,前者是μ-calpain的激活因子,后者是m-calpain的激活因子。UK 114分子量为30 kD的二聚体,ACBP分子量约为20 kD的二聚体,两者氨基酸序列基本相同[9]。UK 114和ACBP的具体结构尚未见报道。

1.4 骨骼肌特异性钙蛋白酶(p94） p94又称CAPNⅢ,是最典型的组织特异性钙蛋白酶。p94在构造上与μ-calpain和m-calpain的大亚基保持高度同源性,但又具有许多自身独特性质,如p94不含小亚基、不形成异源二聚体、活性为钙非依赖性等。p94的基因中存在3个独特的插入序列,即NS、IS1及IS2,认为与其自我消化、酶寿命及与肌联蛋白结合等有关[5]。目前尽管还没有试验证明它能水解肌原纤维中任何一种蛋白,但种种迹象表明,p94与肌纤维代谢活性及宰后嫩度密切相关[10]。

2 钙蛋白酶活性调节

细胞中的钙蛋白酶活性受到Ca2+、钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶激活蛋白的调节,Ca2+、钙蛋白酶激活蛋白是正调节因子,钙蛋白酶抑制蛋白呈抑制性作用,钙蛋白酶的活性表现是它们共同作用的结果。

2.1 Ca2+的调节作用 当钙蛋白酶的大小亚基相结合时,它不具有活性,在被Ca2+激活后其大小亚基分离,大亚基主要起催化作用,小亚基主要起调节作用[11]。钙蛋白酶表现蛋白水解活性,其具体过程为:大小亚基的分离、小亚基的自溶、30 kD亚基迅速降解为17 kD、大亚基自溶、80 kD转化成78 kD再变成76 kD、钙蛋白酶构象发生变化呈自溶状态表现蛋白水解酶活性。除Ca2+浓度调控外,钙蛋白酶的活性还受离子强度、pH值、底物等因素的影响[12]。

2.2 钙蛋白酶抑制蛋白的调节机制 钙蛋白酶抑制蛋白是一种内源性、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂,在大多数组织中其浓度足以抑制钙蛋白酶的活性[13]。当钙蛋白酶被Ca2+激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,将迅速与之结合而抑制钙蛋白酶的活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部特定位点的水解,起到防止钙蛋白酶被随机和过度激活的作用,钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶的这种结合是可逆的,Ca2+浓度不足时两者会发生分离。钙蛋白酶抑制蛋白抑制钙蛋白酶的大致过程为:钙蛋白酶抑制蛋白的第Ⅱ到第V结构域中的A和C保守区,与钙蛋白酶的Ⅳ和Ⅵ结构域紧密结合,然后B保守区与钙蛋白酶的Ⅱ结构域结合而发挥作用[14]。

2.3 钙蛋白酶激活蛋白的调节 钙蛋白酶激活蛋白是钙蛋白酶最直接的调节者,它可明显提高钙蛋白酶的活性,降低其激活所需的Ca2+浓度,使钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用减弱,提高钙蛋白酶对膜的吸附性。当钙蛋白酶激活蛋白发挥激活作用时,首先钙蛋白酶与钙离子直接结合,然后钙蛋白酶激活蛋白激活二者的复合体而不与钙离子直接结合,其激活过程为:钙蛋白酶激活蛋白与钙蛋白酶80 kD的催化亚基结合,并促进其与小亚基的解离,使80 kD的亚基变为78 kD,随后再变为75 kD,这样就使钙蛋白酶的活性大约提高100倍。钙蛋白酶激活蛋白还与钙蛋白酶抑制蛋白通过竞争性地争夺结合位点实现对钙蛋白酶的调控作用[9]。

3 钙蛋白酶与肉的嫩化

肉的嫩化是动物宰后的一定时间内,肌纤维碎裂,肌肉变软,嫩度增加的成熟过程。影响肌肉嫩度的因素很多,包括肌节的长度、肌内脂肪与结缔组织的含量、肌肉结构蛋白水解敏感性、pH值等[13]。大量研究表明,钙蛋白酶引起肌肉中蛋白质的水解,是导致宰后肌肉嫩化的主要原因。钙蛋白酶引发肌原纤维蛋白降解的可能机制是:钙蛋白酶被激活后,首先攻击肌原纤维的肌节,或攻击粗肌丝和细肌丝的连接处N2线,降解连接蛋白和半肌动蛋白,使肌原纤维I带和Z盘结合变弱或断裂,使肌纤维释放出粗肌丝和细肌丝,细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌丝的C-蛋白进一步降解,分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白,然后被溶酶体或胞质蛋白酶所捕获进一步降解,导致肌原纤维的有序结构被破坏,从而有利于肉的嫩化[15]。

4 前景与展望

目前国内外关于钙蛋白酶系统的研究主要集中在其基因cDNA序列分析与克隆、部分内含子的酶切及其与肉嫩度相关性的初步研究等方面,钙蛋白酶系统的详细结构、生理功能及具体调控机理还不是很清楚。随着分子生物技术的发展和研究的不断深入,在完善钙蛋白酶系统的同时,一定会从中筛选出理想的肉质嫩度分子标记,从根本上加快遗传进展,以获得足够嫩度高且稳定性好的肉产品,满足广大消费者的需求。

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