木槟硝黄散的急性毒性及药效学试验

董 虹,吴 伟,马 峥,吕 娟,张 涛,穆 祥,许剑琴

[1.北京农学院 兽医学(中医药）北京市重点实验室,北京 昌平 102206;2.北京市顺义区李桥兽医卫生防检站,北京顺义 101300;3.北京农学院动物科学技术系,北京 昌平 102206;4.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193]

木槟硝黄散是根据《伤寒论》大承气汤的组方原则及家畜用药特点,用木香和槟榔代替大承气汤中的枳实和厚朴组成的。临床上用于治疗马属动物结症,取得了非常理想的效果。方中木香、大黄和芒硝具有疏通肠道的作用,芒硝还可使肠道中保持大量水分,软化粪便;槟榔促进肠管蠕动之力,推荡积粪。四药合力,结粪除,腹痛止,乃治结之良方。为了给临床用药提供参考,本试验进行了该方的急性毒性和药效学试验。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康昆明系小鼠,雌雄各半,体重18～22 g,由北京大学医学部实验动物科学部提供,许可证编号SCSK(京）2006-008。

1.2 中药及试剂制备 大黄、槟榔、芒硝、木香均购自北京同仁堂大药店。按1∶1∶3∶1的药量称取药物,先将槟榔和木香按10倍量加入清水浸泡1 h后,武火加热煎煮,沸后文火20 m in,再加入大黄续煎10min,用4层纱布过滤,最后将芒硝直接溶解于煎好的过滤药汁中。用旋转蒸发仪浓缩至药液中生药含量为1.73 g/m L,置于4℃冰箱保存,备用,试验时以蒸馏水稀释至所需浓度。

复方地芬诺酯片,每片含盐酸地芬诺酯 2.5 mg、硫酸阿托品0.025mg,由常州康普药业有限公司生产,临用前配制成所需浓度的复方地芬诺酯混悬液;阿拉伯树胶粉和活性炭(粉末）由北京奥科生物技术有限责任公司提供。

墨汁的配制:阿拉伯树胶加水配为0.25%透明溶液,称取活性炭粉50 g加入上述溶液中煮沸3次,待溶液凉后加水定容至500 m L,于4℃冰箱保存,临用前摇匀,并加入等量蒸馏水,制得炭粉液供试验用。

1.3 方法

1.3.1 动物饲养条件 室温:22℃±3℃,相对湿度:55%～60%。

1.3.2 急性毒性试验 预试验时将适应饲养7日后的小鼠42只,随机分成7组,每组6只,雌雄各半,各组按等比浓度灌胃给药,确定实验小鼠 0%和100%死亡的剂量范围。根据预试验所用剂量,按公式求出正式试验的剂间比 r。r=log-1

正式试验时将适应饲养7日后的小鼠60只,随机分成6组,每组 10只,组间计量比值为r,按1∶K(K=1/r）等比稀释法,配制等比浓度中药,按0.2m L/10 g灌胃给药,观察记录各组小鼠死亡数。记录给药后小鼠出现的临床症状,及时剖检死亡小鼠并记录剖检结果。根据改良寇氏法公式计算半数致死量(LD50）:LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5）];lgLD50的标准误:SX50=i;LD50的95%可信区间=lg-1(X50±1.96×Sx50）。式中:Xm为最大剂量组剂量的对数值;P为各组动物的死亡率;i为相邻两剂量组比值的对数;∑P为各组死亡率之和;n为每组动物数。

1.3.3 小肠推进试验 取实验小鼠50只,随机分为5组,每组10只,根据《中华人民共和国兽药典(2005年版）》[1]推荐的临床用药剂量,按照体重折算系数换算成小鼠的临床用药量并将其作为中药中剂量(11.28 g/kg）,2倍该剂量为中药高剂量(22.56 g/kg）,1/2该剂量设为中药低剂量(5.64 g/kg）,0.2 m L/10 g,对照组和模型组给予相应的蒸馏水,每天1次,连续灌胃7 d后,进行指标测定。测定前各组动物禁食16 h(其间自由饮水）。测定时,对照组给予蒸馏水,模型组和中药组给予复方地芬诺酯10 m g/kg(0.2m L/10 g体重）复制便秘模型。30m in后,各中药组最后一次给予木槟硝黄散,模型组和对照组给予相应的蒸馏水。30 m in后各组按0.1m L/10 g体重给予配制好的墨汁(活性炭悬液）,25 min后颈椎脱臼处死小鼠,打开腹腔分离肠系膜,剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管,置于托盘上,轻轻将小肠拉成直线,测量肠管长度为“小肠总长度”,从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”,计算墨汁推进率:墨汁推进率=墨汁推进长度(cm）/小肠总长度(cm）×100%。

1.3.4 小鼠排便试验 取实验小鼠50只,随机分为5组,每组10只,根据《中华人民共和国兽药典(2005年版）》[1]推荐的临床用药剂量,按照体重折算系数换算成小鼠的临床用药量并将其作为中药中剂量(11.28 g/kg）,2倍该剂量为中药高剂量(22.56 g/kg）,1/2该剂量设为中药低剂量(5.64 g/kg）,0.2 m L/10 g,对照组和模型组给予相应的蒸馏水,每天1次,连续灌胃7 d后,进行指标测定。末次给药的当天晚上各组小鼠禁食(其间自由饮水）16 h后模型组和中药组给予10 mg/kg体重的复方地芬诺酯(0.2 m L/10 g体重）复制便秘模型,对照组给予等量的蒸馏水。造模30 m in后,各中药组最后一次给予木槟硝黄散,模型组和对照组均给予等量的蒸馏水,30 min后各组按0.1m L/10 g体重给予配制好的墨汁(首粒粪便指示剂）,立即将小鼠放入铺有滤纸的鼠笼内,每笼放小鼠1只,并正常供给饲料和饮水,同时开始准确计时[2]。观察记录每只小鼠首次排出含炭粉粪便的时间,连续观察6 h,记录6 h内小鼠总排便粒数,及时称量排出粪便重量。

2 结果

2.1 木槟硝黄散对小鼠的急性毒性试验 木槟硝黄散对小鼠急性毒性试验的预试验结果,初步确定0%和100%死亡剂量分别是27.70 g/kg体重、69.00 g/kg体重。根据公式计算结果 r=1.2。小鼠的急性毒性试验正式试验结果(见表1）。将表1数据代入改良寇氏法公式中计算得出:LD50=51.54 g/kg体重;LD50的95%可信区间为46.30～57.43 g/kg体重。

表1 木槟硝黄散对小鼠的急性毒性试验结果

小鼠的急性毒性反应和死亡率与给药剂量成正相关。其中高剂量组小鼠短时间内即出现中毒症状:震颤,抽搐,呼吸急促,随后精神沉郁,食欲减退,粪便稀薄。8 h内出现死亡,18～24 h内死亡达到高峰。未死亡的小鼠,给药1 d后恢复正常,继续观察7 d未发现异常,采食、活动恢复正常。死亡小鼠剖检,见胃部膨大、肠道水肿,部分可见肠道有出血点,其他脏器无肉眼可见病变。

2.2 木槟硝黄散对小鼠小肠推进运动的影响 由表1可见,模型组小肠推进率低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01）,表示便秘模型建立成功。经口给予小鼠木槟硝黄散7 d,中药中剂量和高剂量组小肠推进率和模型对照组比较,差异极显著(P＜0.01）,表明木槟硝黄散中剂量和高剂量具有促进小肠运动功效的作用。

表2 木槟硝黄散对小鼠小肠推进运动的影响(±S,n=10）

表2 木槟硝黄散对小鼠小肠推进运动的影响(±S,n=10）

注:与对照组比较,*:P＜0.05;**:P＜0.01;与模型组比较,#:P＜0.05;##:P＜0.01,以下同

组别 剂量(g/kg） 小肠总长(cm） 推进距离(cm） 推进率(%）对照组 - 51.65±0.65 21.50±1.30 41.60±1.99模型组 - 53.25±0.83 11.58±2.08 21.80±4.17**中药低剂量组 5.79 50.22±0.61 11.90±1.11 23.70±2.01**中药中剂量组 11.58 48.68±1.97 15.15±0.57 31.17±1.59**##中药高剂量组 23.16 49.44±1.23 14.32±0.67 28.96±1.45**#

2.3 木槟硝黄散对小鼠排便时间和排便量的影响

肉眼观察粪便性状,可见模型组小鼠排出的粪便颗粒小、硬度大;而中药组的小鼠排出的粪便颗粒大、粪质软、无稀粪。由表3可见,模型组小鼠的首次排便时间、粪便重量与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05）,表示便秘模型建立成功。经口给予小鼠木槟硝黄散7 d后中药中剂量和高剂量组小鼠的首次排便时间极显著低于模型组(P＜0.01）,粪便重量也高于模型对照组(P＜0.05）,差异有统计学意义,表明木槟硝黄散能加快小鼠首次排便时间,增加小鼠的排便量。

3 讨论

木槟硝黄散由大黄、槟榔、芒硝和木香组成,方中大黄苦寒,善于泻热毒、破结滞而荡涤胃肠,为君药。芒硝咸寒,善于润肠燥、软坚结而泻下通便,为臣药。君臣同用,攻下之力大大增强,作用迅速且猛烈。槟榔偏于消积导滞,木香偏于温中行气,二者合用,相辅而行,行气止痛,消积导滞,共为佐使药,四药合力,结粪除,腹痛止,乃治结之良方。

木槟硝黄散的毒性试验还没有相关文献报道,有文献[3-4]显示槟榔煎剂和槟榔碱给小鼠灌胃的半数致死量LD50分别为120.24 g/kg和174.71 mg/kg。本试验显示木槟硝黄散灌服给药LD50为51.54 g/kg,95%可信限为46.30 g/kg～57.43 g/kg。试验过程中小鼠出现少动、呼吸减慢等中毒表现,剖检后可见肠道水肿,个别有出血点。说明木槟硝黄散具有一定的毒性,应引起临床用药的注意。

根据2005年版《中华人民共和国兽药典》中[1]木槟硝黄散的推荐使用剂量进行该方疗效试验,结果显示木槟硝黄散使用中剂量(11.58 g/kg体重）灌服小鼠可显著的提高由复方地芬诺酯复制的小鼠便秘模型小肠墨汁推进率,缩短其排便时间,增加排便量,说明木槟硝黄散具有促进排便的功效。

表3 木槟硝黄散对小鼠排便时间和排便量的影响(±S,n=10）

表3 木槟硝黄散对小鼠排便时间和排便量的影响(±S,n=10）

组别 剂量(g/kg） 首次排便时间(min） 粪便重量(g）空白对照组 - 51.00±7.00 0.81±0.02模型组 - 89.50±30.24** 0.62±0.10*中药低剂量组 5.79 76.89±19.69** 0.68±0.03*中药中剂量组 11.58 55.67±21.45## 0.75±0.17#中药高剂量组 23.16 53.13±20.02## 0.78±0.08#

[1] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典:二部(2005年版）[M].北京:中国农业出版社,2006:414-415.

[2] 史先振,朱圣陶,贺峰.木糖对小鼠润肠通便作用的影响[J].食品与机械,2008,24(5）:42-44.

[3] 申放,曾正.槟榔致癌食者足戒[J].中国民间疗法,1998,6:63-64.

[4] 赵成莹,张继瑜,周绪正,等.槟榔碱、氢溴酸槟榔碱的急性毒性研究[J].中兽医医药杂志,2007,1:33-34.