新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达

杨红军,王豪举

(1.西南大学资源环境学院,重庆北碚 400715;2.西南大学动物科技学院,重庆北碚 400715）

鸡新城疫(ND）1926年首次在印度尼西亚的爪哇和英国的纽卡斯尔艾佛顿暴发。该病是由新城疫病毒(NDV）引起的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽类传染病。ND的预防目前采用灭活苗和弱毒苗接种,但它干扰流行病学调查和监测,不利于控制ND的流行和传播。也使应用受到限制,但在世界范围内仍是危害养鸡业的重要传染病之一[1]。

转基因植物疫苗(transgenic p lant vaccine）是把植物基因工程技术与动物机体免疫机理相结合,生产出能使动物机体获得特异抗病能力的疫苗[2]。动物试验已经证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体后能产生特异性抗体;用转基因植物组织饲喂动物,转基因植物表达的抗原呈递到动物的肠道淋巴相关组织,被其表面特异受体特别是M细胞所识别,产生黏膜和体液免疫反应[3-9]。

本试验通过 RT-PCR获得新城疫病毒LaSota株血凝素-神经氨酸苷酶(HN）基因,定向克隆到植物表达载体pBI121中,构建了含有LaSota株HN基因的表达重组质粒 pBI121-HN,并通过 SDSPAGE对其在苜蓿中表达进行了初步的探讨,为利用植物作为生物反应器奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 病毒及NDV标准阳性血清,购自中国兽医药品监察所;pMD-18-T载体和大肠杆菌DH 5α购自宝生物工程(大连）有限公司;AMV 反转录酶和RNase抑制剂RNasin,购自Promega公司;质粒pBI121及根癌农杆菌LBA 4404由西南农业大学生物工程中心惠赠。

1.2 病毒的增殖与纯化 将NDV LaSota株接种于20枚9日龄鸡胚,37℃孵育,无菌收取尿囊液。并测尿囊液血凝效价[11]。蔗糖密度梯度离心法纯化病毒,-70℃保存备用。

1.3 新城疫HN基因的扩增 参照GenBank中的NDV HN(AF077761）基因高变区核苷酸序列,设计合成1对引物(P1:5′-atgaccaaaggacgatatacggg-3′和 P2:5′-cgccatgtcctacccgtattatt-3′）,引物由宝生物工程(大连）有限公司合成。病毒基因组 RNA用TRIAZOL RNA提取试剂盒,按说明书进行提取;反转录按Promega公司AMV反转录酶说明书进行。

1.4 HN基因的克隆和测序鉴定 将PCR产物经过回收后,与PMD-18-T载体进行 T-A克隆,连结产物转化大肠杆菌DH5α,经酶切鉴定得到阳性克隆。重组质粒pMD-18-T-HN核苷酸序列由宝生物工程(大连）有限公司测定。

1.5 重组表达质粒pBI121-HN的构建和鉴定 根据HN基因的下游序列设计 1条引物,P3:5′-agagctcgccttgtatctcattgccacttac-3′,由 宝生 物工 程(大连）有限公司合成,并引入 SacⅠ酶酶切位点;与通用引物M13,以pMD-18-T-HN为模板,扩增HN基因,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后,定向克隆入表达质粒 pBI121的相应位点,构建重组表达质粒pBI121-HN,经酶切和测序鉴定。

1.6 重组表达质粒pBI121-HN转化根癌农杆菌,并在苜蓿中的表达 用电穿孔法将重组表达质粒pBI121-HN转化到根癌农杆菌LBA 4404感受态细胞中,得到阳性克隆后,带有重组表达质粒pBI121-HN的根癌农杆菌侵染苜蓿愈伤组织,将H N基因转入苜蓿中,对再生植株提取总蛋白质,SDS-PAGE电泳后进行银染,以及Western-blot分析。

2 结果

2.1 病毒的分离与鉴定 病毒接种鸡胚后,24 h内死亡2枚(弃掉）,72 h内死亡5枚,96 h死亡8枚,5枚未死,置冰箱冻死。尿囊液血凝价在1∶26～1∶211之间,且血凝性能被NDV标准阳性血清抑制。

2.2 HN基因的 RT-PCR扩增和克隆 用 TRIZOL试剂盒提取新城疫 LaSota株病毒基因组RNA,经反转录合成第一cDNA,以P1和P2为引物,经PCR扩增出大小为2083 bp的片段(图1）,与预期的片段长度相符,将PCR产物纯化回收后,按常规方法与pMD-18-T连结转化,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定重组质粒(图2）,挑取阳性克隆与进行测序鉴定,测序结果表明,扩增出2 083 bp的核苷酸中包含HN基因的完整阅读框,核苷酸序列同源性达99%,氨基酸序列有2个氨基酸存在差异,均为点突变,对抗原结构影响不大。

2.3 重组表达质粒pBI121-HN的构建和鉴定 重组表达质粒pBI121-HN经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后电泳,出现2 083bb的插入片段和2.9 kb的载体条带,与预期结果相符(图3）,结果表明,HN基因已被正确插入表达载体pBI121中。

图3 pBI121-HN酶切鉴定结果

2.4 重组表达质粒pBI121-HN,在苜蓿中的表达

将鉴定正确的重组质粒pBI121-HN经电穿孔法转化根癌农杆菌感受细胞LBA 4404,筛选阳性克隆,侵染苜蓿组织。对5株再生植株提取总蛋白质,经SDS-PAGE电泳检测,3#、10#、15#和 34#共 4株在蛋白质分子量64 kD处出现一条带,与预期的目的蛋白质大小相符,而对照苜蓿和20#植株没有出现条带(图4）,以NDV多抗血清为一抗,H RP标记的羊抗鼠IgG为二抗,进行Western-b lot分析,结果在64 kD处出现条带(图5）,初步判定HN基因在苜蓿中已经表达。

图4 苜蓿蛋白质SDS-PAGE结果

3 讨论

对于新城疫这种烈性传染病来说,用疫苗预防接种是首选方法。但传统的疫苗接种往往受宿主和病毒两方面的影响而使得免疫失败,即宿主对病毒的免疫耐受力下降及病毒产生变异使宿主不能抵抗病毒的攻击。1992年,Mason H S等[10]提出了用转基因植物生产疫苗的新思路,从而开辟了一条用植物生产可食用疫苗的新途径。其中利用苜蓿表达系统表达动物病原蛋白成本低、蛋白质能够正确折叠、具有口服安全等特点,备受国内外研究人员的广泛关注,到目前为止,人们应用转基因苜蓿作为表达病原抗原蛋白的异源表达载体,成功地表达了多种外源蛋白质[11]。

本文表达载体pBI121-HN是将外源基因功能基因HN基因插入 Ti质粒中,质粒的CaMV 35S启动子是组成型启动子,可以启动外源基因在植物染色体上的表达,HN基因自身带有ATG启始密码子和TGA终止密码子,通过检测新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ）的正常表达,说明HN基因的插入并未破坏基因读码框,也可初步预测HN基因在植物染色体上的成功表达,因而构建的pBI121-HN是一个有效的植物双元表达载体系统。

通过苜蓿蛋白质SDS-PAGE结果初步判定鸡新城疫HN基因在苜蓿中已经表达。利用植物作为载体来表达和传递疫苗的发展给免疫研究注入了新的内容,在21世纪这个生物技术的世纪里,苜蓿作为传统的重要牧草应用于转基因植物疫苗的生产,展示出了良好的应用前景。

图5 Western-blot检测苜蓿中HN蛋白质的表达

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