鼠疫研究进展*

张 涛,冯志勇,李 丽

全球已报道160多种哺乳动物在自然界感染鼠疫,主要是啮齿目和兔形目的动物,还包括食肉、有蹄类和食虫动物及鸟类等染疫。中国发现染疫的宿主动物有80多种,自然染疫的节肢动物有62种,其中蚤目3总科6科22属52种,蜱螨亚纲2科6属8种,吸虱目1科1属2种。鼠疫杆菌可在土壤中生存数周,可在蚤类体内和动物尸体的骨髓内存活很久,还可在植物的根系上存活,高寒草甸草原地区适合鼠疫菌在自然界的长期保存。

中国核心鼠疫自然疫源地表现为生物多样性特征,在鼠疫菌DNA指纹方面表现为随地理分布的遗传生物多样性,推断世界鼠疫最早起源于中亚及中国。上世纪60-70年代开展的全民性爱国卫生及“灭鼠拔源”运动,曾一段时间使我国大部分疫源地处于散发及隐伏状态。但从上世纪80年代末期,随着我国体制改革-农村连产承包责任制的推行,使储粮方式发生根本性改变,由集体转变为分散式的农户(各家各户),正好也为鼠类提供了有利条件,再加上农田及其居民区灭鼠方式的滞后等,导致家鼠鼠疫流行强度成明显的上升态势,从原来的散发状态,进入90年代流行期,到2000-2002年间的高峰期和现阶段的流行末期及散发状态。

1 鼠疫菌生物膜的形成与基因突变

假结核菌进化为鼠疫菌主要是:获得Island09、Island14、Island15三个基因组岛和pPCP、pMT两个质粒,共有pCD质粒上yadA和inv基因的失活、染色体上O抗原基因簇和鞭毛基因簇的突变失活,以及大量的4种IS重复插入序列的出现。

鼠疫菌的进化,(可能)经粪—口途径,借助野生动物肠系膜淋巴结,由小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌进化为鼠疫菌。当然进化过程中也从别的病毒和细菌获取了大量基因。其中一些基因是让鼠疫菌能在哺乳动物体内(血液中)存活,另一些基因则能使其寄生在媒介蚤体内,而不被各种蛋白消化酶所杀死,包括进一步在蚤的前胃中形成菌栓;以及鼠疫菌在蚤体中胃内特定条件下所产生的鼠毒素对自身保护作用—生物膜的形成等;特别是磷脂酶D(PLD)基因的获取,成功实现“鼠-蚤-鼠”间跨物种传播[1]。鼠疫菌一些基因的表达几乎完全受环境和温度调节,鼠毒素ymt基因的转录在蚤体内(26℃)产生的量是在鼠体内(37℃)的3倍多。鼠疫菌染色体上hmsHFRS操纵子是其生物膜在蚤体内形成的关键基因[2],合成生物膜胞外基质中与β-1,6-N-乙酰-D-氨基葡糖类似多糖化合物。HmsT、HmsP和NghA直接参与调节生物膜的形成。HmsT具有二鸟甘酸环化酶活性,可催化c-di-GMP的形成,或作为第二信使促进其胞外基质多糖的合成,对生物膜的形成具有激活作用。HmsP具有磷酸二酯酶的生物活性,能使c-di-GMP线化,对生物膜的形成有抑制作用。NghA具有糖基水解酶活性,能够水解β-N-酰氨基葡糖,NghA大量表达会导致胞外基质表面的聚集作用减弱并使生物膜形成减少。鼠疫菌的NghA基因是个假基因。此外,其一些酶类及转运蛋白也参与其生物膜的形成过程。在对假结核菌生物膜形成的研究中发现,phoP基因缺失的突变株更易形成生物膜[3]。在鼠疫菌phoP基因对其生物膜的形成具有反向调节的作用。假结核菌RcsA基因与调控子RcsB结合为RcsAB复合体后,对其生物膜的形成具有反向作用。在鼠疫菌由于RcsA基因突变为假基因,其功能丧失后不能与RcsB形成RcsAB复合体,因而消除了Rcs调节系统的抑制作用[4]。鼠疫菌HmsT启动子区域具有转录调控子Fur的结合基序。鼠疫菌在蚤体内生物膜的形成过程 :可能是 Ymt、Fur、phoP、RcsAB 等多个调控子共同参与转录水平的结果。鼠疫菌正是通过蚤体内的这种自然选择作用,使具备了形成生物膜及遗传优势的菌株可实现跨物种间传播。

在鼠疫菌基因组中存在大量的重复序列,至少存在 4种插入序列(其中 IS100、IS1661、IS1541、IS285),插入序列的总数超过大多数其它细菌,其中约3.7%的序列是重复序列。这些重复序列是造成鼠疫菌染色体重组变异与进化的关键。鼠疫菌在水平获得外源基因的同时,也发生自身基因的突变(包括假基因)和丢失。基因组包括大约150个假基因,其中51个假基因是由IS插入序列引起,58个假基因是由漂移突变造成,32个是由缺失所致。利用鼠疫菌的全基因组芯片研究鼠疫菌和假结核菌间的进化关系,发现鼠疫菌有11个基因在假结核菌中存在缺失或不可逆性突变,其中4个基因与起源过程有关,这11个基因还包括编码维生素B12受体和昆虫毒素sepC的基因;古老型、中世纪型和东方型菌株的点阵表现出很明显的多样性,鼠疫菌中16个不同基因被鉴定出来;有58个基因属于特定的几种假结核菌,包括高致病毒力岛、3个假基因的自发转座子和数个可能的昆虫毒素及溶血素。致病型鼠疫杆菌可以“制造”丝状噬菌体,而这些噬菌体又可以感染其他杆菌,噬菌体的存在可能只是导致鼠疫杆菌传播的重要因素之一。

鼠疫菌O抗原基因簇位于hemH和gsk基因之间,并与假结核菌O-1b血清型高度同源(98.8%的氨基酸序列相同)[5]。主要是其O抗原基因簇上存在7个缺口,其中5个导致移码突变和相关基因的失活。合成的仅仅是粗糙的脂多糖,脂多糖之间的链不能延伸,无法构成O抗原,因此无法对其血清分型,但可以利用其噬菌体进行分型。鼠疫菌不具有鞭毛结构,无运动性,是因为鼠疫菌鞭毛基因簇突变失活。但在2个假设的鞭毛操纵子之一在与假结核菌间具有高度的可变及其多样性,可以通过识别wzx基因的差异来区分鼠疫菌和假结核菌。

研究发现鼠疫菌有如下特点:①在自然状态下感染了鼠疫菌的蚤类,其胃内含有大量的鼠疫噬菌体。②在蚤类叮咬哺乳动物之前,蚤体内存活的鼠疫菌不能形成荚膜,但可形成生物膜及菌栓。③进入宿主体内的鼠疫菌会被吞噬细胞(单核细胞和巨噬细胞)所吞噬,单核细胞内的鼠疫菌会被直接杀死,只有少部分进入巨噬细胞内的鼠疫菌可存活和繁殖。属兼性细胞内繁殖细菌,能直接诱导吞噬细胞凋亡。④侵入宿主体内的鼠疫菌会再次形成荚膜。⑤在体内繁殖的子代鼠疫菌具有完全抵御PMN细胞吞噬及杀灭的本能。⑥大量繁殖主要集中在肝、脾靶器官,以细胞外繁殖为主。

2 鼠疫菌的免疫和致病性

在鼠疫菌的生命周期中,其致病性基因的表达完全受环境和温度调节。Toll受体是模式识别受体(PRRs)的一种,可以通过识别微生物表面的一些物质而产生炎性细胞因子、共刺激分子以及黏附分子等使NK细胞活化,中性粒细胞表面表达Fc受体增加,ADCC活性增强,参与天然免疫应答。鼠疫菌主要是TLR4识别作用的失活,排斥炎性反应[6]。野生型鼠疫菌能通过抑制Toll样受体4激活,而基因改良的鼠疫菌可激活Toll样受体4。野生型鼠疫菌在37℃生产四酰化毒素,抑制T oll样受体4的激活,使鼠疫菌不能启动炎症保护反应,常常是致命性的感染。转基因或弱毒的鼠疫菌可通过表达六酰化脂多糖激活 Toll样受体4诱导炎症和适应性免疫反应,逐渐清除体内的鼠疫菌,实现自愈和产生免疫记忆。特别是鼠疫菌的3个质粒分别以高拷贝的形式出现在其胞质内,是密度感应系统(quorum sensing,QS)进化的最佳结果,通过这种机制鼠疫菌可以协调基因的智能化表达,迅速改变其表面结构,更好地适应环境、产生致病因子等,使细胞的活动具有组织性,成为类似于多细胞生物的群体性活动。

脂多糖LPS是革兰氏阴性菌共有的免疫刺激活性物。不同的细菌以及同一细菌在不同的条件下能够产生不同结构的LPS分子(变异主要在酰基链的数目、脂肪酸的组成、磷酸化模式),从而具有不同的生物学活性。脂质A的数目和脂肪酸侧链的长度在不同菌及不同的条件下能够发生变化,结构功能分析显示其酰基侧链的数目和长度是T LR4识别的关键。其中含12～14个碳侧链的六-酰基脂质A能够在人体内最大限度的刺激免疫反应。T LR4刺激免疫细胞从而产生前炎性细胞因子(IL1β,IL6,TNFα等)和共刺激分子,发挥抗感染作用。鼠疫菌在借助病媒蚤向宿主侵入的过程中,首先是环境及温度的改变,鼠疫菌合成的LPS是具有刺激性和不具有刺激性结构的LPS组成的混合体[7]。在蚤体内生长时,鼠疫菌能够产生典型的六酰基 LPS,活化T LR4受体。而在37℃(哺乳动物体内),鼠疫菌产生四酰基LPS。研究发现这类四酰基LPS不仅不能刺激活化T LR4,而且能够拮抗六酰基LPS对TLR4的刺激作用。当鼠疫菌从蚤体进入人体后,四酰基LPS开始合成,形成四酰基 LPS与六酰基LPS的混合体从而阻止巨噬细胞的活化和前炎性细胞因子的产生,同时抑制抗原呈递细胞DC的活化和成熟。

天然免疫系统是机体防御病原微生物入侵、抵御感染的第一道屏障,一般在感染后即刻发挥作用。天然免疫与获得性免疫间有着密切的联系,获得性免疫T、B细胞通过 TCRs和BCRs识别抗原,同时依赖初始免疫细胞产生微环境激活抗原递呈细胞。鼠疫菌侵入机体后,不仅天然免疫系统使鼠疫菌不能被吞噬细胞杀灭,而且能够通过对天然免疫系统的作用影响机体的获得性免疫而产生严重的临床反应,故提高机体非特异性免疫力将能减轻鼠疫菌感染后的症状,为鼠疫菌疫苗开发提供一个启发。且三型分泌系统效应蛋白转运至上皮细胞和内皮细胞重构细胞骨架,减少细胞黏附分子如 ICAM1与Eselectin表达,从而阻止PMNs向感染局部聚集。

在感染早期,巨噬细胞成为鼠疫菌的避难场所和转运工具。鼠疫菌通过鼠蚤叮咬侵入机体后首先在局部被中性粒细胞和单核巨噬细胞吞噬。进入皮下组织或黏膜内的鼠疫菌大部分会被直接杀死,只有少数菌会通过吞噬细胞膜上的受体、以胞饮的方式进入吞噬细胞体内,而存活下来。但这一过程,并不引发吞噬细胞内的呼吸爆发(产生的超氧离子杀死鼠疫菌),而是成为鼠疫菌的载体及装配工场,其中鼠疫菌产生的一种外膜蛋白会首先关闭吞噬细胞的线粒体工厂。接着是利用吞噬细胞的营养物质合成自己的一些防护性抗原,成功实现生态位的转换。其中产生的封套抗原会重组吞噬细胞的外膜、产生的其它外膜蛋白酶类会直接降解或破坏吞噬细胞的核染色体DNA结构,造成吞噬细胞的凋亡。不同于大多数微生物,鼠疫菌通过一系列逃避天然免疫系统的作用而引发感染。从吞噬细胞内逃逸的鼠疫菌,因表面具有荚膜样的封套结构,具有抗吞噬作用。同时巨噬细胞可将细菌从感染部位转移到局部淋巴结。鼠疫菌感染机体1～4 h后,就能够在巨噬细胞内表达相应毒力相关因子(F1、LcrV和三型分泌系统蛋白),但其分裂繁殖停止。但这些毒力因子一般在感染后1～2 d才开始发挥作用,不同的毒力因子通过不同的方式作用于机体的免疫系统[8]。前炎性细胞因子启动抗菌炎性反应,包括TNF、IL1、IL6和趋化因子。自然杀伤细胞可以直接杀死肿瘤和感染的靶细胞,在机体早期抗感染免疫过程中起重要作用。鼠疫菌Hfd蛋白参与鼠疫菌抗议吞噬和致病近程。

Yops是在细菌处于不利环境条件下合成和分泌的一系列毒力因子和调节蛋白,是通过Ⅲ型分泌系统直接将多种菌体效应蛋白转移到宿主细胞胞浆内,不需细菌侵入宿主细胞,能在宿主细胞外诱导调节。一类具有抗吞噬功能,另一类具有调节和定位攻击靶细胞的作用。其中YopJ可诱导多种细胞如巨噬细胞、上皮细胞凋亡,通过灭活NF-kb系统,导致抑制a肿瘤坏死因子和r干扰素的产生,从而诱导细胞凋亡。而YopE能干扰宿主细胞的信号传递通路,造成细胞肌动蛋白骨架的改变,抑制吞噬细胞的吞噬功能。鼠疫菌的 YopJ是一种半胱氨酸激酶,作用于巨噬细胞和上皮细胞,阻止有丝分裂原活化蛋白激酶家族成员MKK6和NFκ B信号通路的活化,抑制TNFα和IL8产生,削弱了中性粒细胞的趋化作用。LcrV通过诱导IL10表达而抑制TNF-α和IFN-γ的产生,抑制天然免疫反应。效应蛋白YopM可以进入靶细胞,并通过小泡转运机制从胞质进入胞核,降低巨噬细胞IL2、IL8、IL15和NK细胞IL15R的表达而抑制IFN-γ产生,从而影响早期巨噬细胞的活化[10]。Pla可能通过抑制IL8的产生而降低感染部位对吞噬细胞的化学趋向性。鼠疫菌的YopM通过损耗NK细胞并使NK细胞和巨噬细胞丧失活性而作用于机体的天然免疫反应。鼠疫菌不仅能使NK细胞数降低,并且能够剧烈的降低NK细胞分泌IFN-γ。受动器蛋白(effector proteins)对宿主细胞来说是个消极蛋白,通过破坏机体的免疫系统致使病菌感染宿主。三种致病性的耶尔森氏菌都具有躲避人类的免疫系统,将其受动器蛋白直接注入宿主的细胞质。

在感染(后的4～5d)后期,宿主体内的鼠疫菌开始在巨噬细胞内大量繁殖,并造成巨噬细胞的凋亡,鼠疫菌的释放。这时释放到外界的鼠疫菌已获得抗吞噬功能。鼠疫菌在巨噬细胞内主要合成F1与pH6抗原。F1抗原在鼠疫菌胞外形成凝胶状包膜,抵御中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬。不同于三型分泌系统效应蛋白,F1蛋白不会影响吞噬细胞对其它微生物的吞噬,其通过阻止细菌与吞噬细胞受体间的相互作用而发挥抗吞噬作用[9]。pH6抗原(PsaA)在37℃酸性环境条件下合成,能够选择性与人血浆中的脂蛋白结合而阻止宿主防御系统对细菌的识别。

YopP/YopJ参与诱导细胞凋亡过程,YopJ通过抑制NFκ B和MKK信号转导途径抑制抗凋亡蛋白的产生,促进巨噬细胞凋亡;效应蛋白 YopH和YopE在抗巨噬细胞吞噬中发挥重要作用。YpkA蛋白会阻断宿主的Gα q蛋白,造成细胞外的讯息无法经由Gα q传递到细胞内部,使细胞失去免疫系统的作用。Yersinia的一种外壳蛋白YopJ能够通过将一个乙酰基团加到一个寄主酶上的两个磷酸基团结合关键位点上,从而削弱这种磷酸化级联反应。由于寄主的酶被乙酰化,因此它们不能再被磷酸基团激活,因此这个引发先天免疫应答的酶级联无法被活化。当细胞受到一个细菌病原的感染时,它会活化一个包含多个酶的反应链。一个酶将一个磷酸基团添加给另外一个酶(即磷酸化过程),从而促使这个酶将磷酸基团添加给另外一个酶……。这种级联事件引发一种适当程度的免疫应答。但是,Yersinia能够阻止它的寄主启动这种应答,从而使该细菌能够生存和繁殖。YopH是酪氨酸磷酸酯酶,通过III型分泌系统的分泌装置靶向转运至巨噬细胞,使整个宿主细胞的蛋白去磷酸化,阻断在吞噬机制起始过程中的酪氨酸磷酸化信号。YopH在真核细胞中作用的靶蛋白:局部黏附激酶(FAK)和p130CAP能破坏细胞的黏附复合物,使细胞内吞作用受损。效应蛋白可以抑制吞噬细胞内的呼吸爆发,而失去杀灭吞噬细菌的功能。这种机制可能与效应子 YopE和 YopH有关[11]。鼠疫菌的PhoP box归纳为(T/G)(A/G)TT TA(A/T)七核苷酸同向重复序列,整体调控子PhoP直接调控鼠疫耶尔森氏菌胞内生存能力。

3 鼠疫自然疫源地所表现的生物多样性

生物多样性是指一定范围内多种多样活的有机体(动物、植物、微生物)有规律地结合构成稳定的生态综合体。这种多样性包括物种多样性,遗传多样性及生态系统多样性。鼠疫自然疫源地所表现的生物多样性主要体现在小兽动物、及其体表寄生蚤螨生物、生态系统和鼠疫菌株基因分型的遗传多样性。小型兽类生物多样性决定其体外寄生蚤类生物多样性。特别是在我国核心鼠疫自然疫源地:新疆的天山、青藏高原的三江源和云南省横断山区。

云南省横断山区小型兽类由5目11科58属187种(亚种)组成,蚤类由9科45属 153种(亚种)组成,小型兽类科、属、种丰富度沿纬度梯度带分布的主要特点[12]。滇西北横断山地区地势起伏、高差悬殊,自然条件的垂直变化和水平分异明显,而尤其以独特的垂直自然带引人注目。根据云南横断山区具代表性的7个山系共9个样区山地蚤类及其宿主动物的垂直分布调查结果和引用以往的部分调查资料,对所获数据进行统计学处理,应用不同山系林区各垂直带蚤类物种多样性的平均值作为指标,就云南横断山区蚤类物种多样性的地理分布趋势和规律,与宿主动物和重要环境因素的关系等问题进行了分析和探讨。小兽群落结构、物种丰富度、物种多样性,均匀度和生态优势。横断山区小型兽类沿各纬度和海拔梯度的组成和分布情况不同,但总体呈现出以中海拔和中纬度梯度带物种丰富度都相对较高的空间分布特征。这里蚤类科、属、种、特有种都具有较高多样性,由此推断,这里可能是我国横断山区多物种保存、分布和分化的核心区。

三江源地区存在有2种类型的鼠疫自然疫源地:喜马拉雅旱獭和青海田鼠鼠疫疫源地。三江源地区地貌类型丰富,气候多变,区域物种种类繁多,生态环境变化复杂,具有高原独特的生物多样性特征。也是我国海拔最高的天然湿地,平均海拔4000多米。素有“中华水塔”之美誉,长江总水量的25%,黄河总水量的49%和澜沧江总水量的15%都来自这一地区。三江生态系统最敏感的地区,它是长江、黄河、澜沧江三条大河的发源地。三江源地区具有独特而典型的高寒生态系统,为中亚高原高寒环境和世界高寒草原的典型代表。植被类型有针叶林、阔叶林、针阔混交林、灌丛、草甸、草原、沼泽及水生植被、垫状植被和稀疏植被等,可分为14个群系纲、50个群系。野生动物有兽类85种,鸟类 237种(含亚种为263种),两栖爬行类48种。青海省三江源地区共发现蚤类104种(含亚种),隶属于6科33属,以角叶蚤科、细蚤科、栉眼蚤科种类居多,分别占33.65%(35/104)、27.88%(29/104)和 24.04%(25/104)。羌塘高原亚区发现蚤类5科 16属34种,青海藏南亚区蚤类6科33属100种,其中三江源地区特有蚤类28种[13]。

新疆鼠疫自然疫源地在我国鼠疫自然疫源地的形成及演替方面扮演着关键性的作用。可将新疆4大板块的山地鼠疫自然疫源地鼠疫菌株分为14个基因型:7个主要基因组型和7个次要基因组型[14]。其中西天山北坡灰旱獭-长尾黄鼠鼠疫疫源地存在3个主要基因组型和5个次要基因组型,西段以01型基因组型为主,占种群体的 91.7%,02型占8.3%;中段以03型为主,占68.8%,01型占4.2%,02型占20.85%,另有02M1和02M3(02型的突变型)占2.1%,03M1型(03型的突变型)占2.1%,东段以 02型为主,89.8%,01型、02M2、02M3和02M4型(02型的突变型)各占2.0%。南天山灰旱獭鼠疫疫源地存在2个主要基因型和1个次要基因型,以4型为主,占 66.7%,02型占16.7%,04M1型(04型的突变型)占16.7%。帕米尔高原-阿赖山红旱獭鼠疫疫源地仅存在04型1个基因型。昆仑山喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地分为中昆仑和东昆仑鼠疫自然疫源地,中昆仑山存在2个鼠疫基因组型,以11型为主,占群体的90%,12型占10%;东昆仑山存在3个鼠疫基因组型,以05型为主,占66.7%,02型和11型分别占16.7%。新疆山地鼠疫自然疫源地的演变由3条路线组成。西天山北坡鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因组,自西向东在不同的地理生态环境和宿主媒介作用下发生适应性进化和演变,由较为古老的01型基因组逐渐演化为02和03型,最后南下至青海和东昆仑演变为05型,并且在这条演化路线上存在许多演变过程中发生的基因组地域交叉和次要基因组型;南天山和帕米尔高原-阿赖山鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的04型基因组型是由01型直接演化而来,并在这一区域形成主要鼠疫基因组型;中昆仑山鼠疫自然疫源地的鼠疫菌基因组型可能是由西藏冈底斯山喜马拉雅旱獭鼠疫源地的10型基因组演化而来,形成以11型为主,12型为辅的鼠疫基因组构型特点。具体进化路线图:天山山地→帕米尔高原、昆仑山脉→冈底斯山脉、青藏高原→滇西山地→闽广沿海,期间在滇闽广居民区黄胸鼠鼠疫疫源地由古典生物型菌株进化为东方型,东方型鼠疫菌株经香港及东南沿海的远洋轮船传播到世界60多个国家及地区,引发了第三次世界鼠疫大流行。

鼠疫杆菌与其特定区域的小兽动物、媒介生物、土壤及其微生物和生态系统所具有的不同时空活动特点和生物学特性,以及共同组成的复杂营养食物链网络和在各自能流、物流、基因传递及其协同进化的角色等,都将是鼠疫自然疫源地空间结构研究的所属范畴。同时该地土壤动物群落结构和多样性所反映的生境多样性等,也值得进一步探讨。在鼠疫自然疫源地是否存在致病性的假结核、小肠结肠炎耶尔森氏菌的分布,是近年来学术探讨的焦点。日本学者认为第三次世界鼠疫大流行波及到日本但未造成流行,很可能与致病性的假结核和小肠结肠炎耶尔森氏菌在日本广泛分布有关。因为调查发现这两种致病性的耶尔森氏菌假结核和小肠结肠炎在日本广泛分布。在欧洲,第二次世界鼠疫大流行曾造成当时1/4的人口灭绝。但第三次世界鼠疫大流行也未引起欧洲的鼠疫流行,现在的调查显示假结核和小肠结肠炎耶尔森氏菌在欧洲淡水系广泛分布[15]。动物鼠疫的发生与当地鼠类丰富度、高度差、海拔、相对湿度、年均气温、年降雨量、蚤类丰富度和鼠疫菌基因分型多样性显正相关。

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