调节性容积减小过程中Ca2 + 和pH 对钾通道的调控*

杨林杰， 王立伟， 陈丽新△

( 暨南大学医学院1 药理学教研室，2 生理学教研室，广东 广州510632)

动物细胞在低渗环境中容积胀大时可以发生保护性的调节性容积减小( regulatory volume decrease，RVD) ，K+通道的开放所介导的K+外流是这一过程的重要机制［1］。然而，由于研究技术和方法的限制，对于离子通道活动的研究往往会破坏细胞的完整性和调节能力，因此RVD 过程中整体细胞水平的K+通道活动调节仍需进一步探讨。而在已经充分掌握单个K+通道特性的基础上，可以将不同的调节因素加以整合，构建RVD 过程中整体细胞水平K+通道活动的调节网络。许多动物细胞的RVD 过程中存在胞浆Ca2+浓度和pH 值的改变，本文就这一变化的发生机制及其对RVD 过程中K+通道活动的调节作用作一综述。

1 参与RVD 过程的K+通道类型

参与RVD 过程的K+通道类型与细胞类型有关。早期，在对腹水瘤Ehrlich 细胞的一系列研究表明，RVD 过程中介导容积敏感性K+电流( volume－activated K+current，IK，vol) 的是一种双孔酸敏感性K+通 道( tandem－poredomain acid－sensitive K+channels，TASK) ，该通道的活动对pH 敏感，而不受胞浆的Ca2+浓度影响［2］。随后，大量研究表明Ca2+依赖性K+通道参与多种细胞的RVD 过程，这些通道的活动受胞浆Ca2+浓度调节。在表皮样癌KB－3－1 细胞中，低渗刺激可以激活中度电导Ca2+依赖性K+通道( intermediate－conductance Ca2+－activated K+channel，IK1) ，后者在RVD 过程中起关键作用［3］。在人眼筛板细胞中，低渗刺激可以导致大电导Ca2+依赖性K+通道( large－conductance Ca2+－activated K+channel，BK) 激活［4］。最近，部分研究表明同一种细胞的RVD 过程可以同时有Ca2+依赖性和电压依赖性K+通道发挥作用。电压依赖性K+通道( voltage activated K+channel，Kv) 亚型Kv1.3是参与T 淋巴细胞RVD 过程的主要K+通道类型，同时，IK1 也参与这一过程［5］。Harron 等［6］证实，电压依赖性K+通道Kv4.1、Kv4.3 和Ca2+依赖性K+通道BK、IK1 在人类呼吸道上皮Calu－3 细胞RVD过程中均发挥作用。本课题组最近的研究提示Ca2+依赖性和电压依赖性K+通道在人低分化鼻咽癌CNE－2Z 细胞RVD 过程中均发挥作用，其中IK1 的作用更为重要［7］。

因此，在不同类型甚至同一类型细胞中可以有不同类型的K+通道参与RVD 过程，其中Ca2+依赖性K+通道的活动受胞浆Ca2+浓度调节，而另一部分类型K+通道则对pH 值、电压等因素敏感。RVD 过程中Cl－大量外流可以引起细胞膜去极化，为电压依赖性K+通道的激活提供条件。下面，我们主要针对RVD 过程中胞浆Ca2+浓度和pH 值的变化、机制及其对K+通道活动的调节作用展开论述。

2 RVD 过程中的胞浆Ca2+浓度改变及影响

2.1 RVD 过程中胞浆Ca2+浓度改变 在肾小管上皮细胞、脑胶质细胞、关节软骨细胞等多种哺乳动物中，低渗刺激引起的细胞容积胀大和RVD 过程中均伴随有胞浆Ca2+浓度的升高，并且这一特征性改变在RVD 过程中发挥重要作用［8－11］。尽管在急性分离的小鼠胆管细胞中观察到该细胞RVD 过程不完全依赖于细胞内、外Ca2+，但Ca2+在其RVD 过程中同样发挥作用［12］。

2.2 TRP 通道家族在胞浆Ca2+浓度升高中的作用

瞬时受体电位( transient receptor potential，TRP) 通道家族广泛表达于多种动物细胞，是一类机械敏感的非选择性阳离子通道，在RVD 过程中胞浆Ca2+浓度升高中发挥一定作用。目前，对于TRP 通道家族香草素受体类亚型4( transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4) 在RVD 过程中的作用研究较多，普遍认为该通道起到渗透压感受器的作用，低渗刺激及随后的RVD 过程中TRPV4 通道可介导胞外Ca2+内流，从而使胞浆Ca2+浓度升高［13－15］。Pan 等［13］在人角质形成细胞系HaCaT 细胞中发现，TRPV4 通道激动剂和低渗刺激均可迅速导致胞浆Ca2+浓度升高3 倍，而利用TRPV4 通道阻断剂、去除细胞外液中的Ca2+以及RNA 干扰( RNA interference，RNAi) 技术抑制TRPV4 基因表达均可以抑制低渗刺激引起的胞浆Ca2+浓度升高及RVD。最近的研究证实，TRPV4 通道蛋白N－末端的酪氨酸残基在低渗刺激引起该通道激活的过程中起关键作用，Src 家族酪氨酸激酶( Src family tyrosine kinases，SFKs) 介导的N－末端酪氨酸磷酸化使通道对渗透压敏感性增加［16］。此外，TRP 通道家族的其它通道类型也参与这一过程。在脊椎动物细胞中，对牵张刺激敏感的TRPV1、TRPV2 以及TRP 通道家族经典类亚型7( transient receptor potential channel 7，TRPC7) 均可以被低渗刺激引起的细胞容积胀大所激活［17］。Numata 等［18］在人上皮HeLa 细胞中证实，TRP 通道家族黑色素抑素类亚 型 7 ( transient receptor potential melastatin 7，TRPM7) 的激活和介导的Ca2+内流也参与调节细胞的RVD 过程。

TRP 通道家族活动的调节因素较多。胞浆Ca2+浓度过度升高可抑制TRPV4 的活动，表明该通道的活动调控过程中可能存在负反馈调节［19］。Kerrigan等［10］对牛关节软骨细胞研究中发现，低渗剌激在急性分离和贴壁培养的细胞中导致的胞浆Ca2+浓度升高程度和RVD 比例均相同，然而，介导胞浆Ca2+浓度升高的主要离子通道对通道阻断剂Gd3+的敏感性不同，提示细胞形态或状态不同时，介导Ca2+内流的通道类型可能不同。因此，介导RVD 过程中胞浆Ca2+浓度升高的通道类型除与细胞类型有关，可能还受细胞状态影响。总之，TRP 通道是一类重要的Ca2+内流途径，在低渗刺激下TRP 通道开放介导细胞外Ca2+内流，引起胞浆Ca2+浓度升高，从而可以调节RVD 过程中其它Ca2+依赖性通道的活动。

2.3 胞浆Ca2+浓度升高对K+通道和RVD 的影响

低渗刺激引起的胞浆Ca2+浓度升高对RVD 的调节是一个复杂的过程，可能涉及到对多种酶活性、信号分子的生成以及对直接离子转运系统活动的调节。由于Ca2+依赖性K+通道的活动直接受到胞浆Ca2+浓度所调节，低渗刺激导致的胞浆Ca2+浓度升高可以导致通道的激活。然而，Ca2+浓度升高对整体细胞水平RVD 过程的影响往往要复杂得多。例如在心肌细胞中，Ca2+浓度改变对RVD 起到双向调节作用，低渗剌激导致的胞浆Ca2+浓度升高促进RVD，而Ca2+浓度的升高也使活性氧簇( reactive oxygen species，ROS) 生成增多，对RVD 过程产生抑制［20］。

3 RVD 过程中胞浆pH 值的变化及影响

3.1 RVD 过程中胞浆pH 值的变化 几乎所有的细胞都具有比较完善的pH 值调节机制，在外界刺激以及多种生命活动过程中维持细胞内pH 值( intracellular pH，pHi) 的稳定。然而，多种细胞在低渗刺激后的RVD 过程中存在pHi降低。Lo 等［21］在骨肉瘤ROS17/2.8 细胞中发现，低渗刺激可以使细胞pHi降低约0.7，并且当细胞处于低渗环境中时pHi持续处于低水平。在肾上皮A6 细胞中，低渗刺激同样可以使细胞pHi降低，并且细胞内的酸化可以抑制RVD［22］。

3.2 Ca2+在pH 降低中的作用 RVD 过程中出现的pHi降低与胞浆Ca2+浓度升高之间存在一定因果关系。Souza 等［23］对鸡胚心肌细胞的研究表明，低渗刺激引起的pHi降低可能与胞浆Ca2+浓度升高使线粒体膜上的K+/H+和Ca2+/H+交换体活动增加，将线粒体中的H+转运到胞浆有关。Kuo 等［24］在大鼠肺泡巨噬细胞的研究中发现，细胞内Ca2+浓度的升高可以导致pHi降低，同时可以激活一种pHi敏感的Ca2+依赖性质子通道，将细胞内的H+释放到细胞外。

3.3 pH 值对TRP 通道的影响 pHi降低可以使细胞H+向胞外转运增加，有助于pHi恢复，同时也使细胞外pH 值( extracellular pH，pHe) 降低，对一些通道的活动进行调控。Semtner 等［25］在人胚肾HEK－293 细胞中发现，pHe降低一方面可以使TRPC4 和TRPC5 通道的活动增加，另一方面也抑制TRPC6 通道活动。Cha 等［26］对仓鼠卵巢细胞的研究表明，pHi降低可以直接导致TRPV5 通道构像发生改变，使通道开放机率和单通道电导降低。因此，细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+浓度的升高在一定程度上也受到pH 值调节。总之，多种类型动物细胞的RVD 过程中都存在pHi降低，这一特征性改变与胞浆Ca2+浓度升高之间可以互相进行调节，从而对RVD 过程产生影响。

3.4 pH 改变对K+通道的影响 参与RVD 过程的多种 K+通道活动受到 pHi和/或 pHo调节。Hougaard 等［27］对腹水瘤Ehrlich 细胞的研究表明，参与RVD 过程的TASK 通道活动受细胞内、外pH 值改变调节。pH 值升高和降低可以分别激活和抑制IK，vol，pH 值升高时通道开放数量增多，低渗激活IK，vol的潜伏期缩短，甚至在等渗条件下自发激活。另外，部分研究提示Ca2+依赖性的K+通道也具有pH 敏感性。Pedersen 等［28］在HEK－293 细胞中观察到IK1 通道活动具有pHi敏感性，而pHi降低使通道活动减弱，低pHi时提高胞浆Ca2+浓度也未能恢复通道活动。Church 等［29］对大鼠胚胎海马神经元细胞BK 通道的研究中发现，在细胞内Ca2+浓度相同的条件下，pHi升高可以增加通道开放频率，反之则导致通道开放频率降低。

3.5 整体细胞水平研究K+通道调节的困难和可能性 参与RVD 过程的多种K+通道具有pH 敏感性，因此，细胞pHi调节能力正常的情况下在RVD 过程中细胞整体IK，vol水平可能会发生衰减。目前，对IK，vol特性的研究主要是基于膜片钳技术，由于对RVD 和pH 调节能力影响较大，尚未观察到RVD 过程中IK，vol的衰减过程。然而，在完整植物细胞的研究中直接观察到质子泵活动对K+通道活动的调节。Shabala 等［30］采用自参比离子选择性微电极技术在无损伤的情况下对植物跨膜离子流的研究中发现，质子泵活动产生的H+离子流和K+通道开放形成K+离子流的时相恰好相反，H+离子流为最小值时正好对应K+离子流的峰值，反之亦然。由于质子泵和K+通道活动均可能受pHi影响，H+和K+离子流的交替增减现象可能是pHi波动对质子泵和K+通道活动调控的结果，这为我们进行整体细胞水平离子通道活动调节提供了新的思路。

4 小结与展望

低渗刺激下，细胞容积胀大使TRP 通道激活，胞外Ca2+内流导致胞浆Ca2+浓度升高，使Ca2+依赖性K+通道激活促进RVD 的发生，同时也引起pHi的降低，后者又对参与RVD 过程的各种K+通道产生抑制作用。细胞膜上TRP 通道的活动又受到胞浆Ca2+浓度和pH 的调节。可见，RVD 过程中胞浆Ca2+浓度和pHi的改变构成一个反馈系统，从而形成K+通道活动的调节网络。对整体细胞水平的离子转运调控系统的研究有助于我们在科研和临床工作过程中采用联系、系统的方法进行分析，寻找调控系统中的关键环节，从而更有针对性地施加干预措施。

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