钩端螺旋体的分子分型方法

杨会棉，蒋秀高

钩端螺旋体的分子分型方法

杨会棉，蒋秀高

钩端螺旋体（Leptospira，简称钩体），属于螺旋体目螺旋体科钩端螺旋体属，分为两个种：双曲钩端螺旋体（Leptospira biflexa）和问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）；前者为腐生性钩端螺旋体，通常对人和动物不致病；后者为寄生性、致病性钩端螺旋体，是引起人和动物钩端螺旋体病的病原体。钩端螺旋体病（Leptospirosis，简称钩体病），是由问号钩端螺旋体引起的一种人兽共患疾病，在世界范围广泛分布，尤其流行于热带及亚热带地区。人感染钩体病主要因为直接或间接接触了带菌动物的尿液、受污染的水或土壤。人患钩体病的临床表现轻重不一，从轻微的流感样症状到严重的出现黄疸、肺出血、肝肾等多器官衰竭甚至死亡。目前，国际上对钩端螺旋体的分类方法主要有两种：血清学分类和基因分类。以血清型为基本分类单位的血清学分类，其分类基础是存在于菌体外膜上的脂多糖（LPS）的抗原决定基。在全球范围内，钩体至少包括24个血清群250个血清型［1］。血清学分类的操作主要应用显微凝集试验（MAT）和凝集素交叉吸收试验（CAAT）。该方法需要保存大量的标准菌株，存在操作繁琐，费时费力等不足之处。血清学分型属于表型分型，不能反映菌株之间基因上的联系［2］。基因分类是通过比较基因DNA片段核苷酸序列同源性对钩端螺旋体进行鉴定和分类的方法［3］。目前国际上已经公布的钩端螺旋体基因种有20个［4］。基因分类可从遗传学和分子生物学水平上进一步阐明不同钩体菌株的差别。随着近年来分子生物学技术的发展，一些分子分型方法逐渐被应用到钩体分子分型上。

1 脉冲场凝胶电泳分型

脉冲场凝胶电泳（Pulsed－field gel electrophoresis，PFGE）其原理将细菌包埋于琼脂块中，选用适当的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA片段在外加脉冲电场的琼脂糖凝胶中进行分离。当电场变换方向时，DNA分子在新的方向泳动前必须重新定向。小的DNA分子比大的分子重新定向快，在凝胶中移动也较快。所以通过不断地交替改变电场方向，不同大小的DNA片段能够被分离，在凝胶上按片段长度的不同而呈现出电泳带型。经染色脱色后，在成像仪上呈现酶切后的电泳图谱，再用Bionumerics软件分析，就可以判断菌株之间的图谱异同。

1992年 Herrmann等［5］应用PFGE对致病性钩端螺旋体进行分型，结果显示88．89%（64／72）钩体菌株的PFGE图谱分析结果与血清学分型结果一致。18株临床分离中，有13株钩体的PFGE图谱分析结果符合血清学分型结果。我国蒋秀高等［6］于2000年采用PFGE法检测了我国15群15型钩端螺旋体标准菌株，结果从50～1 000 kb范围的DNA片段得到很好的分离效果，各标准菌株均具有特征性图谱。2008年，Galloway等［7］采用改进的PFGE法检测206株钩体，结果88．83%（183／206）的菌株产生了特征性谱型，同一血清型的不同菌株显示出高度相似的图谱。通过这次研究，他们还建立了应用内切酶Not I产生的钩体PFGE图谱数据库，以便对钩体菌株进行鉴定和评价。Blanco等［8］对14株临床分离钩体菌株进行MAT和PFGE分析，结果显示PFGE分型和血清学分型具有一致性。

1996年美国疾病预防控制中心建立了以PFGE技术为基础的实验室分子分型网络体系，即PulseNet。现在国际Pulse Net已经形成由全球二十几个国家参与的一个比较完善的网络。中国于2004年建立了Pulse Net China，目前正在建立包括中国疾病预防控制中心传染病所中心实验室和分布于各省／市的网络实验室的一个全国性疾病监测网络。

PFGE较其它方法具有重复性好、分辨率高、结果稳定、实验室间结果易于比对等优点；但是，PFGE也存在着费时费力，实验费用较高，需要对操作人员进行专门的培训等不足。另外，应用PFGE分型结果产生的是条带，不是序列，所以在解释时要非常慎重。

2 多位点序列分析

多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是由多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis，MLEE）改进而来的一种细菌分型技术。MLEE是根据多种代谢相关酶的电泳迁移率的不同来反映生物个体间遗传基础的差异，该法的不足之处在于实验结果不能在各个实验室间进行比较。MLST通过分析多个管家基因（Housekeeping gene）的内部片段的核酸序列，从而对菌株的等位基因进行多样性的比较，不同的菌株对应不同的序列型（Sequence－typing，ST），通过比较 ST可以发现菌株之间的相关性。

MLST最初是由Maiden等［9］用于脑膜炎奈瑟菌的分型，后来逐渐应用于其他菌。2006年，Ahmed等［10］首次将MLST技术用于钩端螺旋体分型，他们选取了4个管家基因（adk、icd A、Lip L32、rrs2）和两个候选基因（secY ，Lip L41）设计引物，对120株钩体菌株（包括41株代表不同地方来源的标准菌株）进行基因分型。结果显示，所选取的6个基因中，adk，icd A 和sec Y 高度可变，Lip L32，rrs2和Lip L41中度可变。MLST可用于分子流行病学和种群结构以及生物进化方面的研究。2007年，Thaipadungpanit等［11］采用 MLST对分离自人和储存宿主的钩端螺旋体进行分析。他们选取了pnt A、suc A、pfk B、tpia、mreA、glum 和fad D 这7个基因。研究发现，来自泰国东北部的101株人体分离株产生了12个序列型（ST），ST34占分离株的76%。在2000－2001年钩体病暴发的高峰期间，ST34占所有菌株的85%。ST34在同时期分离自泰国其他地方的菌株中也占优势。此外，7株分离自储存动物的菌株也显示为ST34，只有一株显示为另一序列型。所有显现为ST34的分离株都确认为钩端螺旋体问号基因型秋季血清型。但不是所有的秋季型分离株都属于ST34。相比之下，73株参考菌株产生了59个ST，但没有ST34，从而为这次钩体病的暴发溯源提供了线索。

MLST的主要优点有操作简单、重复性好、有良好的可比性等等。不足之处在于要预先知道待测微生物的基因组序列，以便进行引物的设计；另外就是测序的费用相对较高。

3 多位点可变数目串联重复序列分析

可变数目串联重复序列（Variable number of tandem repeat，VNTR）是染色体基因组上有一定排列规律的DNA短序列，也称小卫星序列。其特点是种类多、分布广、有高度的多态性、重复性和个体特异性。细菌的基因组中存在大量VNTR，分布在基因组的不同位置，将多个这样不同的位点联合起来进行分析可大大提高鉴别能力，该方法即为多位点可变数量串联重复序列分析（Multiple locus VNTR analysis，MLVA）。MLVA的原理是利用与VNTR位点侧翼区互补的寡核苷酸引物相对应DNA进行PCR扩增，由扩增条带分子量来推测重复单位的拷贝数，然后对多组数据进行聚类分析［12］。MLVA 因 其 操 作 简 单 快 速、仅 需 少 量DNA、实验结果数据化，不同实验室间具有可比性等，显示出较好的应用前景。

MLVA技术的难点之一在于VNTR位点的选择。VNTR位点作为基因分型的标记物，是决定该方法分辨力高低的关键因素［12］。2005年，Majed等［13］基于问号钩端螺旋体赖型56601株的基因组序列，选取了44个VNTR位点进行PCR分析，结果有七个位点 （VNTR4、VNTR7、VNTR9、VNTR10、VNTR11、VNTR19、VNTR23）证实可用来做问号钩体血清学分型、流行病学和系统发生学研究。研究发现，L．biflexa和L．meyeri 7个VNTR位点PCR结果阴性，MLVA方法可以区分51株中的43株问号钩端螺旋体菌株。2005年，Slack等［14］以问号钩端螺旋体哥本哈根型FiL1－130菌株基因组为参考，最初筛选出53个VNTR位点，用39株标准钩端螺旋体菌株选出多态性较好的25个位点，再用98株问号钩端螺旋体澳洲型标本鉴定是否具有型间的高多态性，最后确定6个多态性较好的位点（V8、V27、V29、V30、V36、V50），多态性指数介于0．80～0．93之间，98株澳洲型菌株被聚为3大类，其中2类存在明显的地域聚集性，而第3类菌株具有地区多样性。2006年，Slack等［15］重新设计引物，并改变了PCR条件，与多重荧光标记的毛细管电泳联合，将这种改进的MLVA方法应用到之前鉴定过的96株问号钩体澳洲型分离株。结果发现在每个VNTR位点有6～13个等位基因，而在之前的实验中有3～8个。Hunter－Gaston平均变异指数是0．654，原来是0．599；变异的增长很大程度上归因于对VNTR数据的分析。与荧光扩增片段长度多态性（fluorescent amplified fragment length polymorphism，FAFLP）分析相比，两种分型方法得到的图谱具有很高的一致率，而MLVA比FAFLP更能显示一些独特的分型模式。MLVA法的数据分析简单，只需5个等位基因，而FAFLP却需要150～200个等位基因。MLVA的另一个优点是不用培养钩体活菌，可直接对钩体PCR阳性的DNA提取物进行分型。

2006 年，Salaün等［16］以 L．interrogans 赖 型56601、哥本哈根型 Fi L1－130 和L．borgpetersenii哈焦型L550基因组为参考，重新设计引物，对99株钩端螺旋体参考菌株进行检测。研究发现，VNTR4、VNTR7和VNTR10可以成功扩增并区分92%L．interrogans菌株和90%L．kirschneri菌株。对于VNTR7扩增阴性而VNTR4、VNTR10成功扩增的23株L．borgpetersenii，重新筛选位点设计引物，研究发现VNTR－Lb4和VNTR－Lb5可以区分60%的L．borgpetersenii菌株。我国张翠彩等［17］选用 VNTR4、VNTR7、VNTR27、VNTR29、VNTR30、VNTR36、VNTR50这七个位点，对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株共117株进行检测，聚类分析分为A、B、C3个群28种基因型，其中A 群占11．97%（14／117），B群占0．85%（1／117），C群占87．18%（102／117）；多态性指数介于0．0831与0．8005之间；MLVA基因型存在明显的地域性。

4 扩增片段长度多态性分析

扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一种以PCR为基础的分子标记技术。该法一般采用两种内切酶对纯化的DNA进行切割，之后用加接头的引物进行PCR扩增，再对扩增片段电泳后形成的图谱进行比较，在基因组水平揭示细菌之间的多样性。起初实验使用放射性物质标记的引物，现在多使用荧光标记的引物。AFLP具有高分辨率，重复性好等优点：但是该法需要选择合适的酶，也需要纯化大量的DNA。

Slack等［18］应用FAFLP对15株Topaz分离菌株（其中2株分离自动物）进行流行病学研究。Topaz是一个新发现的钩体血清型，属于L．weilii基因种。研究出现了5个主要进化支和13个独特的FALFP图谱。每个进化支都包括分离自不同年份的菌株，而且这些菌株在分离地点上表现出地理聚集性。两株动物分离株的图谱与两株人体分离株的图谱表现出高度的相关性，从而推测人感染此型的钩体与带菌动物有关。Nalam等［19］采用荧光扩增片段长度多态性分析（FAFLP）对分离自不同宿主的271株菌株进行种水平的鉴定并用于构建基因关系图。研究发现，FAFLP是暴发调查和对分离菌株进行聚类分析的重要方法，进行聚类分析时基于菌株的地理分布比基于基因种类型更有力。但是，FAFLP用于分型还不够，不能取代血清学分型。

5 应用LPS生物合成基因选择性PCR扩增对钩端螺旋体进行分型

该方法是近年发展起来的一种新的分型方法。研究发现，LPS生物合成操纵子rfb的核苷酸序列在相同基因种不同血清型的钩体上是不同的，核苷酸序列的不同决定了LPS结构上的差异，而后者是血清型分类的基础。基于这一点，Silva等［20］设计了与LPS生物合成多态位点rfb序列互补的8对引物，目的是扩增出不同的片段。结果，一半的引物对产生了血清型特异性的扩增产物，证明该种方法可以对一些血清型进行鉴定和分组。虽然目前这种方法研究的较少，应用也不够普遍，现在还不够成熟，但是随着研究的不断深入，它很可能成为一种将血清学分类和基因分类联系起来的有力工具。

6 其它方法

限制性内切酶图谱法（REA）其基本原理是利用核酸限制性内切酶对染色体DNA进行切割，产生的酶切片段再经琼脂糖凝胶电泳进行分离。通过分析酶切片段的不同，可以对菌株进行分类研究。2001年，Venkatesha和 Ramadass［21］对来自19株不同血清群的问号钩体菌和2株双曲钩体菌株的DNA做限制性内切酶图谱分析，证明各群型钩体的酶切图谱彼此不同，应用REA可对钩体进行血清型水平的鉴定。REA需要培养大量的菌，而且实验产生的大量条带使得结果的解释和各实验室间数据很难比对［1］。

随机扩增多态性DNA 随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA ，RAPD）又称任意引物 PCR（arbitrarily primed PCR，APPCR）或随机引物PCR（random primer PCR，RPPCR），是一种利用非特异序列的寡聚核苷酸链作引物，对基因组DNA进行PCR扩增的技术。1997年，Pamadass等［22］对属于不同血清型的14株钩体菌株进行RAPD分析，结果每个血清型都产生了独特的可区分的指纹图谱。Corney等［23］应用RAPD指纹图谱方法对46株致病性钩体菌株进行分析，研究结果根据这46株菌产生的图谱可将它们分成8组。RAPD（或者AP－PCR）可对钩体进行鉴定和流行病学研究，但该法重复性较差而且各实验室间进行数据的比对也很困难。

7 结 语

在钩端螺旋体病流行和暴发时，需要对分离菌株进行快速准确分型。分型的意义主要体现在（1）在流行病学方面，追踪传染源、确定传播媒介和宿主，及时控制疫情；（2）不同血清型的钩体致病性不同，分型有助于临床诊断和治疗；（3）有助于研究菌株的进化关系及疫苗的研制。

用于钩体分型的各种分型方法各有优势，但是还没有一种方法将分辨力高，重复性好，可比性强，结果易解释，操作简单，费用低，实验周期短等优点结合起来。在实际应用中，我们要结合实际需要以及实验室的条件，选择合适的方法对分离得到的菌株进行分型。因为用一种方法分型得到的结果可能存在一定的片面性，所以最好用两种或多种方法协同分型。

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R377．5

A

1002－2694（2011）11－1024－04

蒋秀高：Email：jiangxiugao＠icdc．cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，昌平102206

2011－04－26；

2011－07－21