钙离子信号通路及相关蛋白激酶对弓形虫的作用＊

陶 青，赵俊龙

弓形虫是世界范围分布的专性细胞内寄生原虫，可感染人类和所有温血动物的有核细胞。由于宿主的广泛性，弓形虫病已经成为一个全球性的、严重的公共卫生问题，不但危害人类健康，而且成为影响畜牧业发展的重要机会性病原体［1］。钙离子（Ca2＋）是细胞内重要的第二信使之一，在弓形虫入侵宿主细胞的信号转导中起着关键作用［2］。弓形虫速殖子内Ca2＋被各种相关信号通路所调节并释放到胞质后激活依赖Ca2＋的蛋白激酶，进而行使不同的细胞功能［3］。本文综述了Ca2＋及其相关信号通路和蛋白激酶在弓形虫独特生理机制中的重要作用。

1 弓形虫速殖子中Ca2＋生理特性和功能

Ca2＋浓度在静止的弓形虫细胞质中保持着较低的水平，在弓形虫速殖子运动过程中，Ca2＋水平的变化呈现周期性波动趋势［3］。胞内Ca2＋贮存在三个钙库中，包括内质网、线粒体和酸性钙离子体，而内质网是弓形虫贮存Ca2＋最主要的部位。钙库对Ca2＋的缓冲作用很大，在调节胞质内Ca2＋浓度中起到关键作用［2］。胞内Ca2＋在受到外界刺激后，通过信号通路从钙库释放到胞质中。钙库上的钙离子泵可将胞质中的Ca2＋重新泵入钙库，一方面填充由于释放Ca2＋导致的钙库的亏空，另一方面可以降低胞质内Ca2＋浓度，使胞内Ca2＋水平始终处于动态平衡的状态。近年的研究表明，大多数钙离子泵是Ca2＋－ATP酶，弓形虫体内最重要的钙泵是肌质－内质网 Ca2＋－ATP酶（SERCA）。Nagamune等证实了SERCA在胞内弓形虫中位于虫体顶端，便于通过调节Ca2＋水平来影响微线体蛋白的分泌作用，青蒿素或毒胡萝卜内酯可以通过抑制SERCA的Ca2＋－ATP酶活性来破坏虫体胞内Ca2＋的动态平衡。因此，SERCA也成为重要的抗弓形虫的潜在药物靶标［4］。此外，在弓形虫体内还有两个Ca2＋载体，高尔基型 Ca2＋－ATP酶和单体 Ca2＋/H＋增强子，这些钙离子泵共同保持着胞内Ca2＋水平的稳定。

Lovett等通过fluo－4荧光光度测定研究表明随着弓形虫胞内Ca2＋浓度的增加，有关虫体运动性的蛋白质如微线体蛋白2（MIC2）开始分泌，而胞外Ca2＋不是弓形虫运动性的必需因素。在弓形虫滑行运动过程中，胞内Ca2＋从钙库释放，Ca2＋浓度随虫体运动周期性波动，而虫体在入侵宿主过程中和进入宿主细胞内的初期Ca2＋浓度骤降［5］。Wetzel等通过卡米达佐药物刺激试验阐述了胞内Ca2＋浓度在弓形虫滑行过程中的周期性波动伴随着微线体蛋白的分泌，并且胞内Ca2＋浓度周期性的波动变化是弓形虫运动的主要动力。某些药物在影响Ca2＋波动振幅的情况下不会增强弓形虫滑动性，而增加波动频率则会显著增加虫体滑行运动［6］。

2 有关胞内Ca2＋释放的信号通路

弓形虫钙库内的Ca2＋通过两个主要的信号通路—兰尼碱样通路和三磷酸肌醇通路［7］被释放到胞质中，激活相关蛋白激酶，行使第二信使的功能。

2.1 兰尼碱样信号通路 兰尼碱样通路被环化核苷酸二磷酸核糖（c ADPR）所调节［7］。弓形虫受到包括宿主自然配体等外界刺激，体表接收器发出识别信号后激活c ADPR环化酶，使其行使环化功能，以NAD＋为原料催化合成c ADPR。c ADPR可作为第二信使结合到兰尼碱样受体，进而激发钙库中的Ca2＋释放到胞质中。

2.2 三磷酸肌醇通路 以三磷酸肌醇（IP3）为第二信使的信号通路是弓形虫体内介导胞内Ca2＋释放的另一条重要途径。Lovett等通过药理学现象发现乙醇作为天然的Ca2＋刺激剂，可以增加弓形虫体内的IP3含量［7］。与兰尼碱样信号通路相似，当虫体接触宿主细胞配体或外界刺激后三磷酸肌醇信号通路被激活。底物磷脂酰二磷酸肌醇在磷脂酶C的作用下产生乙酰甘油，同时，释放第二信使IP3到胞质中来介导胞内Ca2＋的释放。

3 Ca2＋相关分泌蛋白及功能

Ca2＋做为胞内重要的离子信号介导了多种弓形虫生命过程中必不可少的一些分泌蛋白的释放和调节，在弓形虫的滑行运动、入侵和逃离过程发挥了关键作用。

3.1 Ca2＋介导微线体蛋白2（MIC2）的分泌MIC2由弓形虫微线体分泌，最初以小囊泡形式被分泌出来，当弓形虫与宿主细胞接触后，微线体蛋白囊泡融合，定位在弓形虫顶部表面［8］。在弓形虫入侵过程中，MIC2分泌到虫体顶部后在蛋白酶的水解作用下开裂为胞质内尾区、跨膜区和胞外尾区［9］。胞外尾区可与宿主细胞表面特异受体结合从而使弓形虫粘附到宿主细胞表面。而胞质内尾区则与弓形虫醛缩酶相互作用，并与肌动蛋白相连接促发弓形虫的运动能力。MIC2的分泌可以被Ca2＋载体激发，且只受到胞内Ca2＋水平的影响，Wetzel等用卡米达佐刺激胞内Ca2＋浓度升高可以显著增加MIC2的含量，进而促进弓形虫滑行运动，相反，当螯合了胞内Ca2＋后可抑制 MIC2的释放［4］。

3.2 脱落酸（ABA）介导Ca2＋的释放 最近的研究表明一种植物样通路可以通过ABA控制兰尼碱样信号途径来刺激Ca2＋的释放，进而使弓形虫逃离宿主。ABA在顶器门寄生虫中由类异戊二烯途径衍生而来，在弓形虫胞内裂殖生殖过程中逐渐富集，导致c ADPR的增加而激活兰尼碱样通路，最终使胞内Ca2＋不断释放而引发弓形虫的逃离。Nagamune等用氟啶酮来封闭ABA的生物合成，导致弓形虫无法逃离宿主细胞。由于ABA的缺乏，使弓形虫对环境条件变化的敏感性增强，因此，促进弓形虫速殖子进入一个慢性生长的缓殖子分化时期，最终形成休眠状态的组织包囊［10］。

3.3 Ca2＋介导穿孔素样蛋白（PLP1）的分泌 弓形虫速殖子的细胞逃离作用同样需要另一种微线体蛋白的参与，即穿孔素样蛋白（PLP1），同时要求胞内Ca2＋的促发作用来助于PLP1的释放。PLP1能够对弓形虫自身的纳虫泡和宿主质膜有裂解作用，使膜表面出现孔隙和缺口，有助于弓形虫逃出宿主细胞。PLP1敲除的弓形虫丧失了从纳虫泡释放速殖子的能力，说明PLP1对弓形虫正常生长和免疫逃避至关重要。Kafsack等证明了PLP1由微线体释放，并依赖Ca2＋浓度的调节。当加入Ca2＋载体后PLP1分泌量显著增加，并随着Ca2＋浓度的逐渐升高而增加。用胞内Ca2＋螯合剂去除胞内Ca2＋后，PLP1的分泌也被封闭［11］。另外，弓形虫可以通过感受胞内钾离子（K＋）水平的降低来感知宿主细胞外界或自身引起的损坏，随后，一系列的Ca2＋压力通路被激活释放Ca2＋来调节弓形虫逃离宿主细胞。

4 Ca2＋相关激酶和功能

弓形虫速殖子的滑行运动、宿主细胞入侵和逃离是弓形虫整个生活史中的关键生命进程，亦是弓形虫急性致病的主要原因。弓形虫的所有运动过程都需要MIC2的细胞粘附作用，而MIC2的释放是受到严格调节控制的，这样才能避免宿主机体免疫系统的清除作用。一些蛋白激酶在Ca2＋信号的激活作用下，对MIC2的分泌调节起到了重要作用。早期的研究证明至少有两种不同的蛋白激酶控制着MIC2的分泌，分别是环GMP依赖激酶，即蛋白激酶G（PKG）和钙依赖蛋白激酶（CDPKs）。

4.1 丝氨酸/苏氨酸激酶对微线体蛋白分泌的作用

蛋白激酶G（PKG）属于丝氨酸/苏氨酸激酶，在Ca2＋的激活下成为促使微线体蛋白分泌的重要途径。Wiersma等用一种叫做Cmpd 1的选择性寄生虫抑制剂来封闭PKG的作用［12］。Cmpd 1是一种吡咯－吡啶化合物，可抑制弓形虫MIC2的分泌，从而抑制弓形虫的细胞入侵和运动力。在Ca2＋存在的环境下，随着加入Cmpd 1的浓度升高，MIC2的分泌逐渐减少，当螯合了胞内Ca2＋后，MIC2的分泌被完全封闭。由于弓形虫的细胞入侵和滑行运动都要依赖于MIC2的分泌，PKG的蛋白质磷酸化作用无论在微线体蛋白对膜结构的锚定作用中还是在弓形虫顶部与膜结构的融合中都发挥了重要作用。然而PKG作为分子药物靶标在体内还未得到证实，需要进一步的试验研究。

4.2 钙依赖蛋白激酶（CDPKs）的结构和作用 作为Ca2＋信号的重要效应因子，CDPKs家族的蛋白激酶承担了刺激微线体蛋白释放的主要任务。胞内Ca2＋水平增加激活CDPKs作用于微线体，促使微线体蛋白的释放。CDPKs广泛存在于植物、纤毛虫及原生动物细胞内，而不存在于动物和真菌［13］，因此，CDPKs作为有效的药物靶标更优于任何一种动物体内所含有的蛋白激酶。

典型的CDPKs结构在氨基端有一个可变区与催化区域相连接，在羧基端则拥有一个激活区域（CAD），CAD由连接区和调节区（钙调蛋白样区域）构成［13］。CAD是CDPKs最重要的功能区域，调节着整个蛋白激酶的活化和抑制形式，这是由于此区域羧基端包含典型的EF hand结构。EF hand可以结合Ca2＋使处于抑制状态的CDPKs激活而行使蛋白激酶功能，而连接催化区和调节区的连接区亦叫做自动抑制区，该区域以假底物的形式结合到催化区使蛋白激酶处于抑制状态［13］。CDPKs执行功能需要ATP提供能量，在催化区域内的ATP结合位点中拥有一个独特的看门氨基酸残基，是控制蛋白激酶发挥作用的中枢部位，当看门氨基酸残基突变后就会影响激酶与ATP或激酶抑制剂的结合，导致蛋白激酶的失活或对抑制剂敏感性降低［14］，从而影响微线体蛋白的释放。Ojo等用一种特殊的蛋白激酶抑制剂BKLs来封闭TgCDPK1的活性，使BKLs与ATP形成竞争关系而结合到ATP结合位点。而将TgCDPK1的看门氨基酸残基半胱氨酸突变为天冬氨酸后，由于改变了ATP结合位点的空间大小而明显降低了TgCDPK1对BKLs的敏感性［14］，因此，开发CDPKs的选择性抑制剂具有广阔的前景。

与植物中CDPKs相似，弓形虫的CDPKs结构也变化多样，和植物与纤毛虫中典型的CDPKs结构相比较，并以催化区域为基础，TgCDPKs结构可分为5个主要类型［3］。典型的结构包括氨基端的激酶催化区域和羧基端的4个EF hand。第二类典型的TgCDPKs除了包含4个EF hand外，在催化区域的氨基端有一段稍长的未乙酰化的部分，功能未知。另外一类只拥有3个EF hand，这种结构与植物的钙离子－钙调蛋白依赖蛋白激酶（CCa MK）相似［15］。第四类TgCDPKs的EF hand在催化区域的氨基端，且EF hand的个数可以是一个或者更多。最后，弓形虫还拥有一大类特殊的CDPKs，除了具有典型的CDPKs结构外，在氨基端还有两个或更多的EF hand，同时，有一个plekstrin homology（PH）区域连接了EF hand和催化区域。由于TgCDPKs结构各异，表明其功能多种多样，对TgCDPKs的结构和功能研究成为当今弓形虫研究的热点。

5 结 语

弓形虫Ca2＋信号通路和相关蛋白激酶的作用机制是十分复杂的，但在弓形虫整个生活史中起到了至关重要的作用。Ca2＋和相关蛋白激酶不仅参与了弓形虫速殖子从滑行运动、宿主细胞入侵和逃离的整个过程，而且宿主细胞对Ca2＋的通透性也是宿主抵抗弓形虫的重要步骤。在弓形虫的所有运动过程中，Ca2＋通过兰尼碱样通路和三磷酸肌醇通路释放到胞质内，被释放的Ca2＋结合PKG和CDPKs导致微线体蛋白的分泌，Ca2＋与相关蛋白激酶促发微线体蛋白的释放，这在弓形虫获得运动能力中起到关键作用。MIC2的细胞表面粘附作用使弓形虫具有入侵和逃避宿主细胞的运动性。Ca2＋及其相关蛋白激酶已成为如今研究弓形虫致病机制的热点，现有的研究结果和资料对整个Ca2＋信号通路和蛋白激酶作用机理的阐述不足以精确描述整个过程的作用机制，如弓形虫其他分泌器官的新蛋白的功能研究，Ca2＋其他受体对整个信号通路的作用机制等。

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