上皮-间质转化及相关microRNA分子与肿瘤的恶性行为的研究进展

洪伦 综述 沈守荣 审校

1.长沙市第八医院消化内科，湖南 长沙，410100 2.中南大学湘雅三医院消化内科，湖南 长沙， 410013

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在胚胎形成和伤口愈合等方面起着关键的作用。目前研究发现其与肿瘤的发生、发展有关，癌细胞发生EMT后能获得更强侵袭和转移能力，此外还对肿瘤细胞的耐药性产生影响。以RNA(microRNA，MCR)是新发现的一类非编码小RNA，具有基因转录后调控的作用，在很多生理病理过程中均起着重要作用，包括肿瘤、发生、进展，并与肿瘤EMT有关。

1 EMT现象与肿瘤

EMT，即上皮样细胞向间质样细胞表型特征的转化。此概念是上世纪70年代使用鸡胚研究其形成和发育的过程中所提出的一个假设。而首次描述观察到的EMT现象，则是人们发现人类眼的晶状体细胞能在类凝胶胶质中相对失去极性，转化成间质细胞样形态后同时获得移动能力。往后数年研究中，陆续发现EMT在胚层转化、原胚肠形成及神经嵴细胞迁移等胚胎形成发育领域起重要作用［1］。近年研究又在伤口愈合，组织再生［2］，干细胞分化［3］及肝、肾等器官组织的纤维化病变中也陆续发现EMT，是一种重要的病理生理现象［4］。越来越多的研究发现EMT在多种肿瘤的侵袭及转移等恶性发展过程中起着重要的作用［5-6］。

1.1 肿瘤EMT中的细胞表型变化

可以从上皮细胞与间质细胞各自的特点观察EMT现象发生后的特征变化。上皮细胞是一种有黏聚性的细胞，主要组成上皮组织，覆盖着人机体表面和多个器官管腔内表面。鳞癌、腺癌、移行上皮癌等上皮来源的恶性肿瘤归属此范畴。上皮细胞的特征是细胞与细胞之间有着相对紧密的连接，并且与其所附着基底膜之间有着很强的极性，即相对稳定和不可移动性。而间质细胞是间质及结缔组织的主要组成成分，间质细胞的特征在于结构松散，细胞相对没有极性，有着相对高的可移动性，分散存在于细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)中。这两类细胞结构上的差异同样反映在各自特性的基因和蛋白表达上。

EMT是上皮特征性的细胞发生一定程度的转变，使得其具有部分间质样细胞特征的现象，结合以上描述的此两类细胞的特征后可得出肿瘤细胞EMT现象的实质：具有上皮来源特征性的肿瘤细胞，通过EMT获得间质细胞样的高迁移运动、侵袭浸润能力。EMT过程中，细胞的形态学变化和特征性分子标志可作为判断其发生程度的标准。

1.1.1 形态学变化特征

第一届关于EMT的Boden国际会议提出：在细胞形态学和侵袭运动方面，以4个标准来判断细胞发生了EMT现象：⑴细胞极性的丧失；⑵出现纺锤形样等成纤维样的细胞形态(纺锤形样)；⑶可出现板状/丝状伪足(fp)；⑷侵袭运动性增强。

1.1.2 分子标志物变化特征

EMT是一个动态的、多步骤且调节机制复杂的过程。包括细胞之间黏附的丧失，细胞与周围肿瘤过程中所附着基底膜和ECM的破坏以及细胞骨架的重建而导致细胞迁移力和运动能力的增强这几大基本特征。因而下调上皮细胞黏附相关分子、上调间质细胞特征相关分子及表达各种ECM相关的蛋白是EMT的分子变化特征。

1.1.2.1 下调上皮细胞黏附连接相关分子

E-黏附蛋白(E-cadherin)表达降低或丢失是EMT 最重要的标志性变化。E-黏附蛋白属于1型钙黏蛋白(CDH1)，结构域横跨细胞膜。细胞外部分使得相邻的细胞之间紧密相互结合；细胞内部分则与α-联蛋白(α-catenin)、β-联蛋白(β-catenin)以及肌动蛋白(α-SMA)形成数种复合物，从而组成细胞之间的连接黏附，使得细胞与细胞间有着强大的物理性连接，是维持上皮细胞特性的重要分子， 其丢失的细胞则出现间质细胞样的极性丢失。E-黏附蛋白水平下调以后，此时与之结合的β-联蛋白游离出来，转位到胞核内，与转录因子淋巴增强结合因子(lymphoid enhancer binding factor，LEF)结合形成β-黏附蛋白/LEF复合体，调控的转录。

1.1.2.2 上调间质细胞来源相关分子

间质细胞特征的功能分子，主要是一些间质或胚胎来源的骨架蛋白，在一般上皮细胞不表达或表达非常低下。而发生EMT现象后，这些分子重新表达或高水平表达亦是其标志性变化。

N-钙黏蛋白(N-cadherin)是间质细胞来源的骨架蛋白之一，在正常上皮细胞中基本无表达或很少有表达。其主要功能是介导成纤维细胞的动态黏附，有助于这些间质细胞的移动。N-钙黏蛋白在前列腺癌、乳腺癌和胃癌等多种恶性肿瘤中存在反常高表达。另外，波形蛋白也是细胞骨架蛋白之一，特异性的也分布于间质细胞中，在上皮细胞中基本不表达。波形蛋白表达异常增多导致细胞骨架蛋白构成发生变化，使得上皮源性细胞具有成纤维细胞样特征，更易于迁移游动。波形蛋白在肿瘤中表达上调不仅与肿瘤分级相关，还可促进肿瘤的转移。

1.1.2.3 ECM相关分子

在PCB设计时，需要使用接地器件实现“0”参考点。用于射频接地的器件有3种，分别是“0”电容、微带线和射频电缆。射频模块采用“0”电容接地；通过“0”电容与“无穷大”电感相互配合，尽可能降低电路干扰[32]。

ECM主要包括胶原层黏连蛋白等，功能为促进成纤维细胞及角膜上皮细胞的迁移，特别是层黏连蛋白可促进多种肿瘤细胞的迁移。研究发现：ECM成分不仅促使肿瘤细胞发生EMT，而且发生了EMT 的细胞也能够改变ECM的组成，便于肿瘤浸润和转移。

1.2 肿瘤EMT相关信号通路及转录因子

EMT受各种因素调控，在诱导EMT形成的模型中，信号分子与细胞膜表面特异性的受体结合，进而通过细胞内各条不同的信号转导途径活化， 激活核内的转录因子，从而使细胞表型发生不同程度的转化。故细胞信号转导途径和转录因子的激活等与EMT的发生有着密切的关系。

EMT现象涉及多条信号通路，其中转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)信号传导通路是研究较成熟的EMT通路。多年的研究结果提示：血清TGFβ1水平不仅与肿瘤恶性程度呈正相关，而且也是有效的EMT诱发因素。核转录因子kappaB (nuclear factor kappaB，NF-κB)是 TGF通路诱导EMT发生的重要分子，同样可以促进Snail转录因子的表达，从而下调E-黏附蛋白的表达水平。

Wnt通路也是EMT中1条重要的信号通路，β-连蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，其通过介导与E-黏附蛋白间的相互作用参与细胞间的黏附。β-连蛋白磷酸化破坏了E-黏附蛋白/β-连蛋白复合物的结构，导致细胞黏附力下降，使肿瘤细胞浸润、转移的能力增强。

Ras/MAPK通路受体酪氨酸激酶是一类具有受体酪氨酸激酶活性的膜受体， 是小 GTP结合蛋白超家族成员。MAPK主要参与细胞的增殖、分泌以及神经元分化等生物反应的调节。丝氨酸/苏氨酸酶Raf信号作为Ras的效应物，其削弱TGF的生长抑制和诱导凋亡作用，强化TGF的致侵袭效应，从而诱导MDCK细胞发生EMT。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy Iinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路中PI3K的作用是使磷脂酰肌醇发生磷酸化，产生第二信使进入细胞内进行信号转导。PI3K有2种激活方式，一种是通过Ras和p110直接结合，导致PI3K的活化；而另一种则是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起构象改变而被激活。AKT是PI3K信号转导通路的下游信号，活化的AKT可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。

目前研究较多较成熟的信号通路下游有关EMT的转录因子主要是Snail、Slug、SIP1及Twist等。这类DNA结合蛋白可以通过同SIP1竞争性结合E-黏附蛋白基因启动子部位的E-box连接序列，直接下调E-黏附蛋白及上调间质来源的波形蛋白表达，从而引起EMT。Twist还能直接增强Snail的表达促使肿瘤细胞发生EMT。

2 EMT相关microRNAs与肿瘤的恶性行为

microRNA是一类新发现的长度为19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其与目标mRNA配对，导致目的mRNA发生降解。

2.1 EMT相关microRNAs与肿瘤侵袭转移

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是造成癌症患者死亡的重要原因。肿瘤细胞发生EMT的直接后果包括细胞黏附能力下降、穿破基底膜进入血液循环、逃避免疫监视及在远处部位定植生长等。

2.1.1 与肿瘤EMT负相关的microRNA分子

2007年，Hurteau等［7］发现microRNA-200c在乳腺细胞中的表达与E-黏附蛋白的表达呈负相关，由此人们逐渐将注意力转移到miRNAs与肿瘤EMT相关标志物的关系上。随后，Gregory等［8］又通过生物信息学方法对EMT中重要的转录因子ZEB1的 3’非翻译区(3’UTR)与现已知的microRNA分子绑定序列进行预测分析，继而进行验证之后发现，microRNA-200家族在经TGF-β1诱导的肿瘤细胞发生EMT过程中下调，并且在乳腺癌细胞系中发现此现象。最近，Chen等［9］发现microRNA-429能通过调控ZEB1、VCAN、EPCAM、TSPAN13及CAV2等多种EMT相关基因，使高度恶性的卵巢癌OVCAR3细胞出现EMT，大大降低其侵袭能力。

Wiklund等［10］研究还发现在肌肉转移性膀胱癌组织及低分化膀胱癌细胞系中，microRNA-200家族及microRNA-205同时表达沉默，在其相应的DNA转录区出现超甲基化，并且与不同膀胱癌分期呈明显的相关性。Yu等［11］发现在胰腺癌中microRNA-200c以影响多种细胞上皮标志物表达的方式来调控EMT，从而降低胰腺癌细胞的转移和侵袭能力。在200例不同分期的胰腺癌患者中发现microRNA-200c表达与患者的预后相关。日本学者Shinozaki等［12］发现microRNA-200家族在3种主要EBV相关性胃癌中随着恶性程度的增加，microRNA-200家族的表达逐渐降低。体外实验也证实了这个观点，并且认为EBV感染与microRNA-200的前体表达水平有关。

Let-7是microRNA分子之一，与肿瘤EMT所导致的侵袭转移现象相关。除了研究较多的microRNA-200家族和let-7家族，新发现与肿瘤EMT有关的其他分子陆续被提出。Li等［13］在乳腺癌相关体内和体外实验中，通过抑制microRNA-448的表达，能观察到明显的EMT现象，可能与其靶向调控SATB1 (特别富含AT序列区域绑定蛋白1)基因，进而经过一系列机制增加Twist以及NF-κB的表达有关。Castilla等［14］通过基因芯片阵列技术分析了不同EMT恶性程度的子宫内膜癌组织的microRNA差异发现，microRNA-23b、microRNA-29c和microRNA-203同样具备抑制肿瘤EMT的特征。

2.1.2 与肿瘤EMT正相关的microRNA分子

2008年，Kong等［15］发现microRNA-155的表达在TGF诱导的肿瘤EMT中增高，是通过SMAD4来调控转录活性的，并且在microRNA-155表达缺失的乳腺癌细胞中发现无法有效诱发EMT。在乳腺上皮细胞系诱发的EMT内部比较中发现microRNA-29a及microRNA-21，在间质样细胞系中的表达明显高于上皮样细胞系。同时研究还发现TTP(1种RNA结合蛋白)的表达在表达Ras的乳腺腺瘤细胞中被microRNA-29a抑制从而发生EMT。而microRNA-21则是通过过表达SMAD依赖的转录调控基质从而使得乳腺癌MDA-MB-468细胞系发生EMT。此外microRNA-21还能被BMP-6调控抑制，从而降低癌细胞的侵袭力［16］，最近有研究报道它还能与microRNA-31共同通过抑制TIAM1的表达从而使得结肠癌细胞迁移力性显著增强，从而获得明显的侵袭能力［17］。另外，microRNA-21激活TGFβ信号通路下游的AP1、ZEB1等转录因子不仅使得癌细胞发生EMT，还能通过调控细胞周期和细胞凋亡相关基因(例如TGFβR2、PDCD4、Cdc25A及PTEN等)来影响肿瘤细胞的侵袭转移和抗凋亡能力［18-19］。

E-黏附蛋白下调是EMT的关键步骤和特征。Ma等［20］发现在癌细胞系SUM149中，microRNA-9能增加EMT中细胞间质来源标志物的表达，下调上皮标志物E-黏附蛋白。体内试验证实其通过增加肿瘤细胞-基质间的相互作用的敏感性等微环境来使得肿瘤更具侵袭力。此外，Meng等［21］在肝癌细胞中发现，microRNA-194在肝组织分离出的上皮样细胞中表达较高，而在有高迁移特性的两种间质样星状细胞和Kupffer细胞中几乎不表达。同样在肝癌的体外实验中，间质样肝癌细胞系无法检测到microRNA-194的表达，用实验方法将其过表达后，癌细胞的侵袭性明显降低。

Vetter等［22］报道在MCF7乳腺癌细胞系中，microRNA-661能通过调控Nectin01和StarD10基因的转录，直接影响癌细胞在SNAI1诱导的EMT中体现的恶性程度。

2.2 EMT相关microRNA与肿瘤耐药

恶性肿瘤发生EMT之前主要被认为与更强的迁移和侵袭能力有关。随着研究不断深入，人们发现在肿瘤发生EMT的过程中，细胞表型的变化及有关信号通路及转录因子的改变与肿瘤对化疗药物的治疗反应间存在联系，使得EMT在恶性肿瘤的治疗评估中开始有着越来越突出的地位。而其中microRNA作为有着转录后调控功能的重要小分子，在这一领域发挥着重要作用。

随着放疗或化疗的进行，或在缺氧等应激情况下，多种肿瘤细胞能通过逐渐发生EMT来逃避治疗所导致的凋亡，进而使得细胞具有更强的转移特性。在对紫杉醇耐药的多种人类肿瘤细胞中，比如鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌等，EMT中关键转录因子TWIST的上调是一个共同现象［23］，并且在对吉西他滨和紫杉醇同时耐药的胰腺癌细胞中，在上调TWIST的基础上可同时发现有Snail的表达增强。Yang等［24］在一项使用奥沙利柏长期慢性刺激结肠癌细胞的实验中证实其出现了耐药性增强，且有逃避转移现象，EMT现象在分子水平和形态学上都有极为明显的改变，为耐药性结肠癌细胞与EMT之间的关系提供了证据。

Shrader等［25］曾在建立的20多种不同表型及恶性程度的尿道癌细胞系中进行了药物敏感性实验，即对抗肿瘤化疗药物吉非替尼所导致的生长抑制程度的比较，发现在近一半对药敏感的癌细胞系中表皮生长因子受体(EGFR)水平相对较低，其重要的EMT标志物E-黏附蛋白表达明显比耐药组高。又有研究发现在膀胱癌细胞系中对利妥昔单抗治疗敏感的细胞系多高表达E-黏附蛋白。通过RNA干扰技术使E-黏附蛋白表达降低从而获得更强的肿瘤EMT表型后，观察到肿瘤细胞对利妥昔单抗表现出更明显的耐药现象［26］。

Adam等［27］发现在膀胱癌中，microRNA-200c调控ERRFI-1的表达，后者是EGFR通路上的抑制因子。由于EGFR在多数上皮肿瘤中表达较高，EGFR的抑制很久以来被当作肿瘤治疗药物的一个靶点，microRNA-200c由此降低EGFR通路下游转录因子ZEB1、ZEB2的表达，导致E-黏附蛋白表达增加从而降低癌细胞发生EMT的程度。由此观察到microRNA-200c增强了膀胱癌细胞对基于EGFR抑制原理的普通化疗药物的敏感性。Nam等［28］发现microRNA-200c的下调提示卵巢癌患者化疗敏感性极低，预后更差，术后生存期也相应缩短。在对西妥昔单抗和顺铂耐药的非小细胞肺癌的研究中，Ceppi等［29］发现，该类肺癌细胞间质来源标志蛋白表达非常高， EMT现象特征十分明显，还发现其启动子区的超甲基化是导致microRNA-200c表达低下的原因；并通过将microRNA-200c过表达能部分恢复细胞对顺铂治疗的敏感性并降低其侵袭能力。最近Tryndyak等［30］发现在耐多柔比星治疗的乳腺癌细胞中，其表达的microRNA-200家族除抑制ZEB1转录因子外，还可能通过抑制SIRT1表达间接地使E-黏附蛋白启动子的组蛋白乙酰化，从而使癌细胞的EMT表型变化，改变其耐药和侵袭转移能力。

Li等［31］将数种不同的胰腺癌细胞归类成吉西他滨耐药及敏感两类，在其之间进行microRNA阵列芯片分析及后续验证实验后发现，microRNA-200家族和let-7家族使得胰腺癌细胞EMT与耐药有着密切的关系。同样通过基因芯片技术还发现，microRNA-214、microRNA-130a、microRNA-27a和microRNA-451也与卵巢癌的耐化疗药物有关［32］。通过对环磷酰胺、表柔比星、氟尿嘧啶联合或单用化疗耐药并且用药后出现新转移灶的一批乳腺癌患者的研究发现，其体内肿瘤细胞较对照组细胞呈更典型的EMT表型状态，且其microRNA-448表达明显下调。研究认为microRNA-448是通过作用于其靶基因SATB1，增加双调蛋白表达水平，进而增加了EGFR受体调控的EMT关键转录因子——Twist的表达，并且激活NF-κB通路来实现该类肿瘤细胞的高耐药性和强侵袭性。在研究治疗肿瘤药物方面，最近Oliveras-Ferraros等［33］发现曾经作为糖尿病治疗药物的二甲双胍在对乳腺癌细胞MCF-7进行诱导处理后，能对细胞产生抑制EMT的作用，降低其侵袭转移能力。同时还发现EMT相关microRNA分子Let-7a及microRNA-96明显上调。对处理前后的细胞样本进行miRNA芯片筛选后发现，microRNA-181a与TGFβ信号通路及乳腺癌细胞对药物敏感性有关，从而引起EMT相关的肿瘤细胞自我更新。

3 结语

越来越多的研究报道已经提示，EMT与肿瘤的侵袭转移和耐药有关。此外，随着实验技术的进步，特别是对microRNA机制研究的不断加深，如今对肿瘤EMT在各领域的认识，将与不断涌现的新研究概念结合起来，从而在诊断和治疗上取得突破。随着Krutzfeldt等［34］发现能在机体内沉默特异性microRNA的方法，为未来基于肿瘤EMT相关的microRNA的治疗提供了新希望。目前，提供更明确的临床证据以及阐明与各种复杂通路途径的交互作用机制，是了解肿瘤与EMT关系的难点和重点，仍需要大量研究和深入探讨。

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