癌睾丸抗原OY-TES-1在脑胶质瘤中的表达及其抗体血清学分析

李希圣 严峻 罗彬 贺菽嘉 范蓉 林永达罗昱 肖绍文 谢小薰,4

1.广西医科大学第一附属医院神经外科，广西 南宁 530021；2.广西医科大学组胚教研室，广西 南宁 530021；3.广西中医学院组胚教研室，广西 南宁 530021；4.广西医科大学基础医学中心实验室，广西 南宁 530021

*：现工作单位为滨州医学院附属医院神经外科，山东 滨州 256600

胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，目前的治疗仍以手术为主，放、化疗为辅。尽管这些传统的治疗方法已有了很多改进，但是患者的中位生存期仍不足1年［1］。免疫治疗是一种新的辅助治疗方法，目前已用于肿瘤治疗，具有一定的临床疗效［2］。中枢神经系统一直被认为是一个免疫豁免区，但近年来的许多研究发现，恶性脑肿瘤常伴有血-脑脊液屏障破坏，免疫细胞穿越血-脑脊液屏障进入脑组织，以及脑组织的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)表达上调，这一现象提示开展脑肿瘤免疫治疗具有一定的可能性［3］。

癌睾丸(cancer-testis，CT)抗原是一类在多种肿瘤组织表达的抗原［4］。目前一些CT抗原如Mage-A1、A3的肿瘤疫苗已进入临床实验，在一些颅外肿瘤的治疗中收到了较好的疗效［5］。由于胶质瘤低表达或不表达这些CT抗原而制约了将其用于胶质瘤免疫治疗。因此，有必要对一些新筛选出的CT抗原做进一步的研究，探讨哪些CT抗原具有用于胶质瘤免疫治疗的可能性。

OY-TES-1是CT抗原家族中的一员［6］。根据它在CT抗原数据库中的排名，又称为CT23。最近的研究发现，OY-TES-1蛋白与有丝分裂纺锤体蛋白NuMA相互作用，导致细胞恶性转化，抵抗化疗药物紫杉醇的作用［7］。为了解OY-TES-1在胶质瘤的表达情况及是否具有免疫原性，本研究初步检测了OY-TES-1 mRNA和血清抗体，并结合临床病理指标进行分析。

1 材料和方法

1.1 标本和主要试剂

胶质瘤患者肿瘤标本及配套血清51例，其中男性32例，女性19例，年龄8～65岁，中位年龄35岁，均来自广西医科大学第一附属医院神经外科2004年—2008 年的住院患者；所有肿瘤标本均经病理检测确认，收集血清标本之前患者均未接受任何治疗。健康人血清107例来自广西医科大学学生。

RNA提取试剂盒(北京天根生化公司)，逆转录试剂盒和Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)，Cellstar 96孔酶标板(Greiner bio-one公司)，生物素-山羊抗人IgG单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-streptavidin)(美国KPL公司)，TMB(美国Sigma公司)。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

取50～100 mg于-80 ℃保存的组织，迅速加入裂解液，电动匀浆仪匀浆，步骤按公司提供的说明书进行。所得RNA溶于无RNA酶的纯水中，电泳检测RNA质量，无明显18 S和28 S者予以舍弃。取2 μg总RNA，进行cDNA合成，所得的cDNA用P53引物作PCR扩增以检测其质量。P53引物序列及PCR反应条件参照文献［8］。

1.3 目的基因RT-PCR扩增

PCR反应体系为30 μL，包括1 μL cDNA、上下游引物各1 μL、dNTPs、Taq DNA聚合酶及PCR缓冲液等，置反应物于PCR仪。OY-TES-1引物序列及PCR反应条件参照文献［6］，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。每轮RT-PCR反应中，采用正常睾丸cDNA为阳性对照，同时设立不加模板的空白对照，以排除假阳性的可能性。

1.4 OY-TES-1融合蛋白制备

带麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein，MBP)标签的OY-TES-1重组质粒由本课题组构建［9］。将OY-TES-1重组质粒转化感受态细胞(42 ℃热休克法)，接种单菌落于含0.2%葡萄糖、100 μg/mL氨卞青霉素的LB培养液，37 ℃剧烈振荡至D600为0.5～0.7，取1 mL菌液作为诱导前对照，加入IPTG终浓度为0.5 mmol/L，30 ℃诱导表达2 h。收集菌液，4 ℃以5 000 r/min离心10 min(Sigma公司3K15离心机)，每克菌体沉淀加入3 mL过柱平衡液(20 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，1 mmol/LEDTA，10 mmol/L β-巯基乙醇)和50 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF) 8 μL，反复冻融3次，冰浴超声裂解细菌，在4 ℃以12 000 r/min离心20 min(Sigma公司3K15离心机)，收集上清液并加入Amylose Resin亲和层析柱中，随后加入12倍柱床体积的过柱平衡液，以洗去非特异结合的蛋白，最后用10 mmol/L麦芽糖洗脱缓冲液过亲和层析柱，收集含OYTES-1融合蛋白洗脱液。测定D280，SDS-PAGE电泳鉴定纯度，将含有融合蛋白的洗脱液合并收集，待浓缩冻干。

1.5 ELISA检测

将1.0 mg/L的OY-TES-1融合蛋白加入酶标板(100 μL/孔)，4 ℃包被过夜。用PBST(PBS含0.05% Tween-20)在室温下洗板3次，50 g/L脱脂奶于37 ℃封闭1 h，上待检血清(1∶400)于37 ℃温育1 h，随后用IgG单克隆抗体(1∶10 000)于37 ℃温育1 h，洗板后加入HRP-streptavidin(1∶1 000)，37 ℃温育30 min，再次洗板加TMB避光显色15 min，用1 mol/L硫酸终止反应。酶标仪(美国Thermo公司)测定D450值。以包被MBP为阴性对照，进行统计学分析。以大于健康人平均吸光度值3个标准差者为阳性。

1.6 统计学处理

应用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析，样本率的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OY-TES-1 mRNA在脑胶质瘤组织中的表达

脑胶质瘤OY-TES-1 mRNA阳性率为80.4%(41/51)，统计学分析显示OY-TES-1 mRNA表达与脑胶质瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理分级等参数无关(图1，表1)。

2.2 血清抗体的检测结果

ELISA检测107例健康人血清抗体，吸光度均值为0.686±0.125；以健康人D450均数加3个标准差值为Cut-off值(1.061)，判定抗体阳性的血清。在所检测健康人血清中无一例抗体阳性(图2)。

图1 OY-TES-1 PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of OY-TES-1 PCR products of glioma tissues

表1 OY-TES-1mRNA及其抗体与胶质瘤相关临床指标的关系Tab.1 Correlation between ACRBP/OY-TES-1 mRNA expression, sera antibody and clinicopathological features in glioma

51例脑胶质瘤患者血清OY-TES-1抗体阳性率为15.7%(8/51)。抗体D50均值为0.811±0.283，明显高于健康人血清抗体均值(P＜0.01)。在各种病理类型的胶质瘤中，OYTES-1抗体阳性率各异；其中Ⅰ～Ⅱ级星型细胞瘤患者抗体阳性率为25%(4/16)、Ⅱ～Ⅲ级星型细胞瘤患者为11.1%(1/9)；1/2室管膜瘤、1/11多形性胶质母细胞瘤和1/1髓母细胞瘤患者可检测到OY-TES-1抗体；而间变性星型细胞瘤等6种胶质瘤患者未检测到OY-TES-1抗体(图2)。

图2 ELISA 检测血清OY-TES-1抗体Fig.2 Detection of sera OY-TES-1 antibody with ELISA

3 讨 论

本研究结果证实在脑胶质瘤中OY-TES-1 mRNA亦有较高的阳性率。由于基因的转录还涉及到诸多调节机制，故mRNA的表达不能完全代表其蛋白的表达情况；目前有关OYTES-1蛋白在卵巢癌中表达率为69%［10］，在肝细胞癌中为40%［11］。因此，下一步尚需了解OY-TES-1蛋白在胶质瘤中表达情况。

本研究结果同时证实胶质瘤血清OYTES-1抗体的阳性表达率为15.7%(8/51)，同时再次证实在健康人血清中无相应的抗体，表明OY-TES-1抗体具有肿瘤特异性。尽管统计学分析显示OY-TES-1抗体的出现与临床指标无关联，但值得注意的是，恶性程度高(Ⅲ～Ⅳ级)的胶质瘤更易产生OY-TES-1抗体，这可能与肿瘤浸润生长快、损伤血-脑脊液屏障严重有关。下一步需要扩大病例数，尤其是恶性程度高的胶质瘤，同时需要对抗体进行动态的观测，才能真正了解其临床意义。此外，OYTES-1作为一种抗原能在胶质瘤患者体内引起体液免疫反应，但当它被MHC I类分子呈递至肿瘤细胞的表面时，也有可能诱导产生细胞免疫反应。最近已有研究鉴定出一个OY-TES-1的HLA-A24 限制性抗原肽，用该抗原肽诱导的细胞毒T细胞(cytotoxic T cell，CTL)能在体外特异性地杀伤OY-TES-1 mRNA阳性的肺癌细胞株［12］。虽然这是一个体外实验的研究，但提示OY-TES-1在体内可引起细胞免疫反应。

本研究结果显示，OY-TES-1 mRNA在胶质瘤中具有较高的阳性率，并能在胶质瘤患者体内引起体液免疫反应，提示OY-TES-1用于胶质瘤免疫治疗具有潜在的临床应用价值。

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