纳米技术在阿尔茨海默病基因诊断的研究进展

周竹青 易 黎 韩金玲 沈惠敏 (北京大学深圳医院,广东 深圳 58036)

阿尔茨海默病(AD)难以早期确诊,尚缺乏灵敏、快速、准确的活体诊断技术,确诊率较低。因此,寻求早期诊断AD,特别是应用纳米技术检测AD易感基因,已经成为了神经变性疾病领域的研究新热点和难点。现就AD的基因研究现状以及纳米技术在早期诊断AD的应用与进展综述于下。

1 AD的基因研究现状

AD是老年人中常见的中枢神经系统变性疾病〔1〕,特征性病理变化为大脑皮层萎缩,并伴有 β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积,神经原纤维缠结,大量记忆性神经元数目减少以及老年斑的形成。临床上以50～60岁以后进行性加重的智能障碍、记忆力减退、精神运动异常为主要症状〔2〕。截止2005年,全球该病患者已有两千多万,每年新发病例460多万(每7秒新增1例患者)〔3〕。我国65岁以上人群遭受该病困扰的人数估算已超过600多万〔4〕。AD是继癌症和心脏病后第三位花费最大的疾病,给患者家庭和社会均带来了极大的负担〔5,6〕。AD可划分为家族性和散发性,目前的治疗尚无根本性进展,多以早期预防和准确诊断为主。而AD的确诊,除了在患者病逝后通过大脑的病理检查老年斑和神经原纤维缠结这些指标进行疾病的回顾性诊断外,临床上主要依靠神经科医师以临床病史采集(NINCDS-ADRDA诊断标准〔7〕)和神经心理量表测定(MMSE、ADAS-Cog〔8〕等),影像学检查等为诊断手段,尚缺乏灵敏、快速、准确的活体诊断技术,因而其诊断率目前仅有 10% ～15%〔9〕。在AD众多的可能病因中,如遗传、环境、代谢、病毒感染等多种因素,遗传因素是其主要原因之一。目前已知与AD相关的基因至少有50个,主要分布在染色体的1、6、12、14、17、19和21号,这些基因的变异频率AD患者较正常人要高3～5倍,其中有些基因与家族性AD相关,有些与散发性AD相关〔10〕。下面就AD相关的主要基因及其功能蛋白质的研究进展展开讨论。

1.1 载脂蛋白E(ApoE)基因 1973年,Shore等首次在正常人极低密度脂蛋白中发现ApoE。ApoE基因位于19q1312,全长3.7 kb,有 4个外显子,3个等位基因(ε 2、ε 3和 ε 4),分别编码产生 E2、E3、E4三种蛋白。3个等位基因中,ε 4是目前公认的AD危险因素,与散发性AD关系密切。ε 4与40%～50%的早发性AD及80%的迟发性AD相关,并与AD发病率呈剂量-依赖性关系,可使AD发病年龄提前;而 ε 2和 ε 3可使 AD发病率降低,发病年龄延迟,是一种保护性因素。其机制可能是ε 4等位基因与淀粉样前体蛋白(APP)基因间相互作用,影响其水解位点,增加 Aβ沉积,导致早老素(SP)发生和胆碱不足。ApoE3和ApoE4与Tau蛋白间存在相互作用,ApoE3可与Tau蛋白形成耐受十二磺基磺酸钠的复合物,ApoE4则不能。这提示ApoE3可结合并调节Tau蛋白的磷酸化,促进微管蛋白装配;而ApoE4的作用正好相反。迟发性 AD伴ApoEε 4等位基因患者的脑组织中,其Aβ沉积高于迟发性AD未伴 ApoEε 4等位基因患者;提示ApoEε 4等位基因是个体发生AD的危险因素,在AD发生发展中起重要作用。另外,Persson〔11〕等发现在AD发病以前,ApoEε 4的存在可影响显微镜下胼胝体白质的完整性。Trittmatter〔12〕研究证实,在 AD患者的脑脊液中发现ApoE与Aβ可高度结合,因此推测ApoE在患者SP的形成中有分子伴娘作用,参与调节淀粉样蛋白的形成。由于 AD的ApoE4升高具有较高的特异性,ε 4等位基因与AD发病有关,是散发性AD最重要的危险因子,因此建议将其列入AD的基因诊断标志。

1.2 淀粉样前体蛋白(APP)基因 APP基因位于21号染色体,长约300 kb,由19个外显子组成,与 AD紧密连锁,是最早发现与AD相关的突变基因,为常染色体显性遗传,与家族性早发型 AD有着密切关系。正常生理条件下,多数 APP由 α-分泌酶裂解成可溶性 β-APP释放到神经元外,β-APP被 γ-分泌酶裂解,极少部分 β-APP在胞质经溶酶体内的 β-和 γ-分泌酶作用裂解为 Aβ〔13,14〕。当APP基因发生突变时,突变的APP产生新的酶切位点,易被 β-分泌酶水解,并在 γ-分泌酶作用下形成游离 Aβ;Aβ越长,毒性作用越强,这是因为它能聚集到更多的Aβ,装配成不溶性的共聚体沉淀,这是Aβ神经毒性的结构基础。聚集的Aβ形成不可逆沉淀,最终导致 SP形成,从而引起AD。AD的发生与APP基因的过度表达以及经 β-和 γ-分泌酶产生的Aβ在脑内堆积和沉淀有关。Aβ是各种因素诱发AD的共同通路,是 AD形成和发展的关键因素。Hardy〔15〕等提出的淀粉样蛋白级联假说认为,Aβ在大脑皮层堆积是AD病理发生的早期关键事件,最终导致AD其他的病理变化。

1.3 Tau蛋白基因 Tau蛋白基因位于17号染色体,在种系间高度保守,Tau蛋白是其表达产物,主要分布于人类大脑额叶、颞叶、海马及内嗅区等部位,是体内含量最高的微管相关蛋白。目前,在成人脑组织中发现6种Tau蛋白异构体,其相对分子质量为48 000～67 000,有352～441个氨基酸。AD患者脑中Tau蛋白发生异常修饰,过度磷酸化,随之聚集成双螺旋纤维丝形式(PHFs),丧失了促进微管组装的生物活性,故导致细胞骨架结构异常和神经细胞死亡〔16〕。AD患者部分过度磷酸化Tau蛋白是可溶的,另一部分沉积在PHFs中为不可溶的,称为PHF-Tau。PHF-Tau沉积于脑中可致神经元变性。

1.4 早老素1(PS-1)和早老素2(PS-2)基因 PS基因是目前发现的另一个与AD发病密切相关的基因。PS占家族性AD致病基因的30%～50%,占早发型 AD致病基因的70% ～80%。PS-1和 PS-2基因分别定位于14和1号染色体,即14q24.3和1q41.2,长约75和90 kb。PS-1和PS-2属进化保守基因家族成员,其疏水外型是具有大量跨膜区域的整合膜蛋白,基因产物位于内质网和高尔基体,提示PS可能在分泌通路上调节蛋白质的转运和合成。PS-1或PS-2突变基因患者Aβ42升高可能由于PS-1或PS-2蛋白质功能异常所致。迄今已发现至少37种PS-1基因突变与早发性AD有关〔17〕。一定条件下,PS-1基因突变细胞选择性地导致纤维原性较强的、易聚集的Aβ42产生过多,从而导致AD发生。PS-1基因缺陷可通过抑制β-APP的 γ-分泌酶发生裂解,减少 β-APP形成。另外,PS-1基因突变还可引起Tau蛋白等细胞骨架蛋白之间的相互作用异常,破坏离子通道的微结构,影响细胞内外离子交换,引起AD病理改变。突变的PS-2基因表达产物可通过对C末端肽水解酶的影响而作用于APP的水解过程,使聚集性Aβ产生增多而发生沉积,形成SP,协助Aβ升高细胞内钙,加重氧自由基产生,促进线粒体膜电位下降,从而引起细胞凋亡。梁平〔18〕等研究结果表明突变型PS-1(M146L)导致 Aβ1-42的分泌增加,提示PS-1有可能作为预期的 γ-分泌酶参与APP分解生成 Aβ的过程。也有人认为PS是一种 γ-分泌酶的协同因子或 γ-分泌酶通路中的协调物〔19〕。 De Strooper〔20〕则提出,PS-1 与 PS-2 可能是γ-分泌酶催化亚基。因此 PS对 APP代谢过程是如何作用的尚有待研究。以上是对AD主要相关基因Apo E、APP、PS-1和PS-2等位基因的研究现状的总结,那么如何早期检测这些AD相关基因,尤其应用高新技术灵敏高效地检测AD致病基因？

2 纳米技术在早期检测AD患者基因的应用与前景

检测基因的方法,目前诊断医学主要有放射性核素和荧光分析法。其中荧光分析法因其操作程序简便,观测安全而较受重视。但是,传统的荧光染料具有一定的缺陷:易光漂白和光解,故检测的特异性较低;观测时间极短。而放射性核素的检测方法虽有高灵敏度的优越性,但因其对环境的高污染危害而渐趋淘汰。目前研究的纳米技术既有灵敏度和特异性高的优点,又弥补了上述方法的缺陷,可用于检测AD的易感基因,详述如下。

2.1 应用纳米晶体标记探针检测散发性AD的ApoEε 4基因

目前已陆续发现多种基因如 APP、PS1、PS2、ApoEε 4、A2M、LRP1、TNF、ACE、MTHFR 和 mtDNA 等与 AD 相关〔21〕。近年来,发病率更高的散发性AD受到较多的关注。ApoEε 4等位基因是ApoE主要基因型之一,其第4号外显子上有2个位点发生变异。ApoEε 4等位基因与AD发病有关,是散发性 AD最重要的危险因子。确定ApoE基因型有助于临床筛查和早期诊断大部分相关患者,筛查需要进行干预治疗的人群。

杨华静等〔22〕应用荧光半导体纳米晶体与ApoEε 4等位基因特异性寡核苷酸反应合成探针,来检测AD阳性标本和阴性标本的ApoE的基因型,得出新型荧光探针检测结果与标本基因型一致的结论,并大胆推测荧光半导体纳米晶体标记探针将替代传统方法,有望成为一种有效可靠的早期筛选AD的方法。这种新型材料荧光半导体纳米晶体,标记寡核苷酸探针,用于检测 ApoEε 4等位基因,具有灵敏度和特异性高的优点,荧光检测时间窗长达数天,其无毒无害的特点相对于目前临床上应用的放射性核素,具有更大的优越性〔23,24〕。

2.2 应用纳米磁珠技术早期检测家族性AD患者APP基因研究表明〔15,25〕,APP基因突变可能是导致具有遗传异质性的家族性AD(FAD)的重要病因之一。FAD患者的21号染色体上APP基因第670和671位氨基酸密码子存在突变,揭示了APP基因突变可能是导致FAD患者脑内Aβ过量沉积的关键原因。Aβ是构成FAD特征性的病理改变之老年斑的核心成分,同时也被认为是FAD最重要的致病物质之一。因此准确检测APP基因型有助于早期筛查FAD,对该疾病的防治有着重大的社会意义。纳米颗粒(Nano particles)被誉为21世纪的新材料,其概念在20世纪中叶被科学界提出后得到了广泛重视和深入的发展。纳米颗粒尺度一般为1～100 nm,介于原子簇与一般微粒子之间。其所具有的量子效应,表面效应与协同效应使其展现出许多特有的性质,如比表面积大,表面活性中心多,毒性低且不易受体内和细胞内各种降解的影响。随着纳米技术的迅速发展,纳米颗粒逐渐被应用到细胞生物学和分子生物学研究领域。尤其是纳米磁珠(MNP)在医学病原微生物检测中的广泛应用,充分显示了其良好的医学应用前景。

我们拟应用纳米磁珠与APP等位基因相对应的特异性寡核苷酸互补形成纳米芯片探针,结合该目标单链寡核苷酸,特异、高效、快速富集受检者口腔拭子标本中APP基因的痕量DNA(可低于105,称低拷贝模板),结合后续PCR等检测技术,为早期全面准确基因筛查FAD患者,提供一种新型高灵敏度,简易快速,特异性的基因诊断技术。纳米芯片探针一旦研发成功在大规模人群中筛查推广使用,可具有重大社会意义。

3 总结与展望

随着对AD相关基因及其蛋白质研究的深入,以及越来越多与AD相关新基因及其功能蛋白质的不断发现,已知的与AD相关基因新的突变位点和所表达的蛋白功能也会越来越清晰。随着各种基因和蛋白质研究技术的不断发展,将会在基因和蛋白水平上探讨AD的发病机制并找到一条早期诊断AD的途径,进而采取有效的治疗措施。

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