幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展

杨武晨，郭 红

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）是一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌，与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的发生密切相关。近几年的研究显示，H.pylori感染还与缺血性心脏病、动脉粥样硬化、缺铁性贫血等胃外疾病相关［1］。尿素酶是H.pylori中含量最为丰富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，结构亚单位为尿素酶A和尿素酶B。其中，尿素酶B亚单位（Urease subunit beta，UreB）为尿素酶的活性亚基，在幽门螺杆菌的致病过程中起着至关重要的作用，相对分子质量较大，约为64 000，具有高度的保守性和免疫原性，是H.pylori最佳的疫苗候选抗原之一。

1 幽门螺杆菌疫苗研究概论

H.pylori是人类上消化道疾病的重要致病菌。1994年，世界卫生组织已将其列为人群第一类致癌因子［2］。目前，临床上主要是通过“三联”或“四联”疗法来对H.pylori感染的患者进行根除治疗，但因药物的副作用大，患者的依从性差，耐药菌株的逐渐增加，使其应用受到了较大的限制。且根除治疗并不能预防H.pylori的感染与根除后再感染。幽门螺杆菌疫苗能诱发机体的特异性免疫应答清除感染，又可激发机体的免疫记忆来预防再次感染，且副作用少。因此，自从幽门螺杆菌被发现之后人们便广泛开展其疫苗的研究［3］。现有疫苗主要有以下几种形式：

①全菌灭活疫苗——较为传统的疫苗 其抗原成分较为复杂，包含了H.pylori的所有抗原成分，可以诱发机体产生高效的免疫应答。但是，特异性不高、副作用较大、易发生交叉免疫反应，不适用于人体接种，具有一定的局限性。

②亚单位疫苗——疫苗研究的重点 其抗原成分具有较全菌疫苗的简单、成分清楚、安全性好、特异性强等优点。常见的亚单位疫苗的抗原主要包括：尿素酶及其B亚单位（UreB）、细胞毒素相关蛋白A（Cag A）、粘附素（Hpa A）、热休克蛋白（HSP）、空泡毒素（Vac A）、脂多糖（LPS）等。目前，UreB作为抗原的疫苗研究较多。

③联合疫苗/多价疫苗——两种或多种抗原成分 使用单价疫苗存在着一定局限性，为了克服单种抗原免疫原性弱、免疫效果不强等缺点，联合疫苗/多价疫苗可获得比单价疫苗较好的免疫保护效果，能明显提高动物的免疫保护率。

④核酸疫苗——第三代疫苗 较常规疫苗相比具有生产制备简便、高效、广谱、廉价、无致病性、易存储以及能激发机体细胞和体液免疫应答等优点。

⑤表位疫苗——疫苗发展的新方向 机体的免疫应答不是针对整个外源物质（抗原），而仅仅只是抗原的一小段区域，即抗原表位。表位疫苗，就是使用抗原表位制备而成的疫苗。根据抗原表位的不同，分为B细胞表位疫苗、T细胞表位疫苗和兼具有2种表位的多表位疫苗［4］。目前，UreB的B细胞表位和Th细胞表位鉴定已有文献报道［5－6］。表位疫苗具有易于生产、特异性高、免疫原性强、安全性较好等特点。表位疫苗，是近年来疫苗设计的新思路，具较好的应用前景。

2 尿素酶B亚单位的主要特性

无论疫苗是什么形式，其核心仍是组成疫苗的抗原成分。尿素酶B亚单位之所以能够成为研究最为广泛的幽门螺杆菌疫苗抗原，与其特性密不可分。H.pylori中尿素酶是含量最为丰富的蛋白，占H.pylori可溶性蛋白的5%～10%，是H.pylori重要的定植因子和毒力因子。尿素酶是一种含有Ni离子的金属酶，活性部位的镍离子含量决定尿素酶的活性。其由A、B 2个结构亚单位和辅助蛋白组成［7］。Ure A与UreB结构蛋白，主要功能是通过水解尿素生成氨和二氧化碳来调节细胞内外或/和周质的p H值，保护H.pylori抵抗胃酸的作用，促使菌体定植于胃黏膜，在菌体致病过程中发挥着重要作用。

UreB缺乏尿素酶的全酶活性，具有无毒性和较高的免疫原性，能有效诱导机体的免疫保护作用，相对分子质量较大，约为64 000。不同H.pylori菌株间UreB核酸序列有高度的同源性，高度保守，用UreB作为免疫原具有较高的稳定性。实验证实，UreB比尿素酶的另一结构亚单位Ure A具有较好的免疫保护性。目前，大量的动物实验已经证明尿素酶B亚单位具有免疫预防和免疫治疗的作用，安全性和有效性进一步得到了验证。尿素酶B亚单位是H.pylori的主要特异性抗原，直接从H.pylori菌株中分离UreB的量少，而通过基因重组技术来制备大量的UreB，为建立特异性的UreB疫苗奠定基础。因此，常把尿素酶B亚单位作为疫苗设计的最佳候选抗原。

3 尿素酶B亚单位的疫苗研究进展

3.1 UreB的亚单位疫苗/多价疫苗 过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的预防C57BL/6小鼠感染人类幽门螺杆菌（H.pylori）的作用，保护免疫率达到83.3%（20/24）［8］。李明峰等［9］构建表达了幽门螺杆菌的热休克蛋白A亚单位（Hsp A）和尿素酶B亚单位（UreB）的重组蛋白质的侯选菌株。融合蛋白免疫BALB/c小鼠，结果观察到，免疫的小鼠血清中均可检测到抗Hsp A和UreB的抗体，而对照组则无相应抗体。Hsp A－UreB融合蛋白有可能作为一种有效的双价候选疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。UreB和Hpa A双价重组疫苗联用，并辅以佐剂r LTB时对小鼠具有较高的免疫保护率［10］。二价或多价疫苗较单价疫苗的免疫效果强。无论是以UreB蛋白为抗原的亚单位疫苗还是与其他亚单位抗原联合的多价疫苗，虽然都具有一定的免疫保护效果。但是，可能存在：①抗原成分复杂，特异性不高。②免疫佐剂对人体健康造成危害等问题。这就要求人们寻找更为安全有效的疫苗。3.2 UreB的核酸疫苗 曾韦锟等［11］、徐灿等［12］都从不同的H.pylori菌株中成功构建了幽门螺杆菌UreB核酸疫苗，但是都没有进行动物实验去验证其免疫原性。袁小澎等［13］扩增了幽门螺杆菌2个保护性亚单位UreB、Hsp A基因，进行基因融合，成功构建了H.pylori双价DNA疫苗，免疫小鼠后能够产生特异性抗体，显示出良好的免疫原性。刘秀丽等［14］将H.pylori的 UreB－Hsp A融合基因成功构建到腺病毒载体上，免疫小鼠3次，在第2次加强免疫后7 d、3次免疫后的14 d，血清抗UreB－Hsp A的IgG抗体滴度基本保持在2次免疫时的水平，抗体效价最高可达1∶2 000，新鲜粪便检测sIg A，显示产生了特异性抗体黏膜sIg A，说明重组病毒能够激发机体UreB－Hsp A的特异性体液免疫和黏膜抗体免疫反应。但是，融合基因表达的蛋白较大，特异性不高，免疫原性不强。

3.3 UreB的表位疫苗 国内外关于UreB的表位疫苗研究取得了一定的进展。UreB蛋白含有569个编码氨基酸，使用全长蛋白作为疫苗研究的抗原，存在抗原表位组成成分复杂、特异性不高、免疫应答不强等局限性。如果能找到激发机体免疫应答的免疫保护性优势表位，即用UreB的小片段蛋白，来替代全长的UreB在疫苗中发挥作用，制备高效、特异性的表位疫苗，能激发机体较强的免疫应答，从而达到预防和根除H.pylori的感染。

目前得到的UreB表位大部分是B细胞表位。Qiu Y等［15］确定UreB的线性表位，3个B细胞线性表位的覆盖了15个氨基酸（AA）氨基酸区域在158－172，181－195和 UreB的349－363。肽与谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合免疫小鼠，显示抗原表位肽特异性抗体能抑制尿素酶活性。在临床应用价值较大，这些肽作为抗原表位疫苗来治疗H.pylori具有重要的意义。Li HX等［16］使用截短法分段构建含UreB抗原的重组质粒，用IPTG诱导表达融合蛋白，对表达产物进行鉴定。初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（UreB）单克隆抗体（m Ab）6E6识别的抗原表位位于200－230位氨基酸。但是抗体在H.pylori感染的免疫保护中的作用是非必需的还是必需的目前还不确定，有研究也表明清除H.pylori感染的过程中抗体仍然具有一定的免疫保护作用。特别是抗体具有中和尿素酶的活性对于免疫保护是有利的。

研究显示，H.pylori的免疫保护机制趋向于依赖CD4＋T细胞，而并非CD8＋T细胞的免疫反应。幽门螺杆菌表位疫苗设计前提是筛选辅助性T细胞（helper T lymphocyte，Th）表位，明确各表位激发的免疫应答特性。Shi Y等［5］通过使用RANKPEP预测获得7条可能的H－2d限制性的Th细胞表位，其中 3 条表位肽 U546－561，U119－244，和U237－251能够刺激r UreB致敏的 BALB/c（H－2d）小鼠的CD4＋T淋巴细胞的增殖。U546－561和U229－244能诱导Th2类型的细胞因子分泌。然而，U237－251能诱导Th1类型的细胞因子分泌。实验证明，这些免疫优势表位能刺激机体产生特异性的免疫应答，应用于相应的表位疫苗研究能取得较好的免疫保护效应。

为了避免抗原结构中可能存在的抑制性、致病性以及非必需表位的影响，合理组合设计具有保护性B细胞和Th细胞表位的多表位疫苗，能够激发机体较强的特异性免疫应答。Zhou WY等［17］已经设计和构建了一个多表位疫苗（命名为 HUepi－LTB），包括作者前期蛋白鉴定的UreB 3个新的H－2d限制性Th表位（U546－561，U229－244，和 U237－251）、尿素酶的一个 B细胞表位 U327－334、Hpa A的一个B细胞表位（H132－141）和粘膜佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）。相对于口服PBS免疫组，多表位疫苗能显著的降低H.pylori的定植作用，并且能产生抗原特异性CD4＋T细胞的应答和IgG和粘膜Ig A抗体的产生。

无论是哪种免疫保护机制，是核酸疫苗、亚单位疫苗还是表位疫苗，都具有各自的缺点和优势，其最终目的都是能够引起机体的细胞免疫和体液免疫应答，发展更为简便、安全和有效的疫苗，治疗和预防H.pylori的感染。然而在实现全面、彻底、高效、预防、治疗和根除H.pylori的感染和再感染方面，UreB表位疫苗则具有较好的开发应用前景。

4 展 望

随着人们对UreB疫苗研究的不断深入，使用UreB疫苗来根治和预防H.pylori的感染将有可能得到实现。UreB疫苗具有在菌体中含量丰富、特异性强等优点；缺乏天然的蛋白天然结构、容易引起免疫耐受、常用的佐剂可能存在潜在的毒性作用等缺点。然而，抗原通过氨基酸修饰、多表位串连展示到有效载体上，能提高其与抗体的亲和力，增强抗原的免疫原性和稳定性。

表位疫苗作为未来疫苗的发展趋势，具有很多的优点。如：相对于亚单位疫苗的成分简单；相对核酸疫苗不存在潜在的威胁；特异性较其他疫苗高。表位的成功筛选和鉴定方法已经得到广泛的应用。从已报道的文献来看，动物实验结果令一些对表位疫苗感兴趣的学者欣喜［18］。但是，表位疫苗的研究仍然面临多方面的考验：如何选择有效的方法，筛选和鉴定有效的抗原表位成分，以此来作为疫苗的候选抗原，产生大量特异性抗体和淋巴细胞，提高其免疫反应性；如何选择有效的载体分子；目前表位研究主要是在实验小鼠上得到验证，基于人的表位疫苗研究如何；表位疫苗在多种HLA中的限制性，在人群中的作用规律如何等等，都是人们在以后的研究中必须去关注的内容。研究UreB表位，特别是优势表位，对揭示UreB的有效作用成分、阐明H.pylori疫苗的作用机理，对发展更安全有效的H.pylori疫苗具有理论指导意义。

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