假肥大型肌营养不良患者骨骼肌纤维再生病理特点研究

赵清石 鞠浩 刘海燕 刘川 李海平

假肥大肌营养不良是一组因肌肉缺乏抗肌萎缩蛋白，引起的进行性肌肉变性疾病，为X连锁隐性遗传，分为杜兴型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和贝克型肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）[1]。主要表现为缓慢进行性加重的对称性骨骼肌萎缩和无力，最终完全丧失运动功能。其病理以肌纤维的变性、坏死和再生为主要表现[2]。其发病机制虽得到公认，但对于该病尚无有效的治疗方法。研究该病肌纤维再生特点，探索肌纤维再生的相关因素具有重大意义。本实验收集1998～2008年间临床及病理诊断明确假肥大型肌营养不良患者骨骼肌标本25例，研究其肌纤维再生特点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 假肥大型性肌营养不良25例，其中DMD18例、BMD7例。DMD患者按年龄分为三组：3～6岁组、7～8岁组、9～13岁组，每组6例。再生肌纤维用NCAM标记，观察各组年龄、病程及再生肌纤维个数。肌营养不良的诊断均确立在临床、病理及实验室检查基础之上[1]。

1.2 方法

1.2.1 标本获得 2％利多卡因局部麻醉，肱二头肌开放式骨骼肌活检。

1.2.2 标本处理 液氮/异戊烷冷冻，7μm连续冰冻切片。

1.2.3 组织化学及免疫组织化学染色分析 组化为HE染色，观察再生肌纤维特点。

免疫组化采用ABC免疫组织化学染色。试剂包括鼠抗人NCAM单克隆抗体（1∶50，美国 Santa Cruz Biotechnology公司产品）；动物血清（马血清，中美合资兰州民生海洋生物有限公司）；ABC试剂盒（美国Vector Laboratories公司产品）。

1.2.4 形态计量学分析 200倍光学显微镜下完成对再生肌纤维的定量，每个活检标本至少有两张切片参加计数，每张切片再生肌纤维数量的评估至少在6个显微镜视野内完成，以每单位视野面积中NCAM阳性肌纤维数表示再生肌纤维（fibers／200倍视野），应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统版本9.0，通过图像分析和计算测得再生肌纤维面积、直径。以获得数据为基础，得出再生肌纤维平均直径、平均面积情况。

表1 NCAM染色下神经肌肉疾病再生肌纤维形态定量分析

表2 DMD患者年龄分组（NCAM标记再生肌纤维）

表3 DMD患者年龄分组再生肌纤维统计表

图1 DMD HE染色×200

图2 DMD NCAM染色×200

1.2.6 统计学方法每个标本的再生肌纤维值取其各个显微镜视野平均值。各组数据以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析：用单因素方差分析（ANOVA）进行多组间均数比较，组内均数两两比较用方差分析进行多重比较（q检验）。

2 结果

2.1 再生肌纤维病理特点 在HE染色中，DMD患者骨骼肌肌纤维大小不等，可见大量变性、坏死和再生肌纤维，坏死呈灶性分布，结缔组织增生。BMD病理改变较DMD轻，变性、坏死和再生散在，结缔组织不同程度增生。NCAM作为再生肌纤维的标记物，通过HE染色和抗NCAM单克隆抗体染色同源纤维比较，观察到HE染色下再生肌纤维深染，胞质嗜碱性深染，细胞核大；NCAM染色可见再生纤维越幼稚，染色越深，晚期再生染色浅，成熟肌纤维、炎性细胞和结缔组织均不着色（图1、2）。假肥大型肌营养不良再生肌纤维形态基本相同，但是肌纤维再生活跃程度不同：DMD再生活跃，发病年龄均较小；BMD再生不活跃，且年龄偏大，肌纤维直径大。

2.2 再生肌纤维形态计量学分析 使用光学显微镜在200倍下观察，对活检标本进行计数，每个标本至少选取两张切片，每张切片至少选取6个显微镜视野进行再生肌纤维数量的评估，以每单位视野面积中NCAM阳性肌纤维数表示再生肌纤维（fibers／200倍视野），应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统版本9.0，通过图像分析和计算测得再生肌纤维平均面积、平均周长和平均直径（表1）。可见BMD患者再生肌纤维明显大于DMD患者再生肌纤维（表2）。DMD患者随年龄增长再生肌纤维数量逐渐减少（表3）。

3 讨论

骨骼肌纤维在受到化学、物理及机械损伤时具有旺盛的再生能力，研究肌纤维再生过程、肌纤维再生的相关因素是解决肌病基本特别是肌营养不良治疗的重要手段[3]。假肥大型肌营养不良是一组遗传性疾病，儿童早期起病，迄今尚无有效治疗手段。对于假肥大肌营养不良，特别是DMD，大量实验发现其再生活跃，因此探索其再生特点，寻找促进其肌纤维再生、成熟的因素具有重大价值。

本研究可见假肥大型肌营养不良再生肌纤维形态基本相同，但是肌纤维再生活跃程度不同。DMD患者普遍年龄较小，骨骼肌病理发现其再生较活跃。BMD患者年龄多较DMD偏大，再生活跃程度较DMD差。同时本研究表明DMD患者骨骼肌纤维再生随年龄增长再生亦逐渐减弱。国外研究表明[4]，正常情况下，哺乳动物骨骼肌有很好的自我修复能力，都会随着衰老而发生萎缩，这可能是常年正常使用时引发的损伤未能及时修复的积累结果。随着年龄的增加，损伤后肌肉的再生能力也将降低，肌肉正常再生能力跟不上过度受损的速度，导致出现肌肉的无力及萎缩，这可能与肌卫星细胞数目减少和（或）增殖能力的减弱有关。有研究表明，在再生中起重要作用的卫星细胞数量在肌病患者1岁左右开始增加，3～9岁达高峰[5]。本实验发现DMD患者8岁前再生较8岁后明显活跃，可能由于肌卫星细胞的增殖分化，不能弥补肌营养不良患者肌肉修复过程中由于不断激活而导致的卫星细胞池的衰竭。在DMD患者中，卫星细胞增殖加强的地方，端粒（细胞反应年龄的指示器）的长度与正常老年人一样都过早缩短。而且，在动物模型中，随着年龄的增长或重复的再生，卫星细胞的增殖潜能减弱[6]。因此可以解释我们的实验中，在年龄小的患者的肌纤维再生较年龄大者活跃。因此假肥大型肌营养不良易及早治疗，早期促进肌纤维再生，减少肌纤维变性、坏死具有重大意义，当达到一定年龄后肌卫星细胞池耗竭时，再行治疗在某种程度上来讲意义不大。

[1]沈定国.肌肉疾病[M].北京：人民军医出版社,2007：214-218.

[2]吴世文,马维娅译.临床肌肉病理学[M].3版.北京：人民军医出版社,2007：40-50.

[3]Grefte S，Kuijpers-Jagtman AM，Torensma R，et al.Skeletal muscle development and regeneration[J].Stem Cells Dev，2007，16（5）：857-868.

[4]Buricchi F，Chiarugi P，Fiaschi T，et al.During muscle ageing the activation of the mitogenic signalling is not sufficient to guarantee cellular duplication[J].Biochem,2005，54：258.

[5]Edstr m E，Altun M，Bergman E，et al.Factors contributing to neuromuscular impairment and sarcopenia during aging[J].Physiol Behav,2007,92（1-2）：129-135.

[6]Boncompagni S，Kern H，Rossini K，et al.Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007，104（49）：19339-19344.