细胞间隙连接蛋白26、32的研究现状

李 纳 郭瑞珍

（遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041）

细胞间隙连接蛋白26、32的研究现状

李 纳 郭瑞珍

（遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041）

细胞间隙；连接蛋白26、32；研究现状

细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）是生物体内相邻细胞间通过细胞间隙连接通道互相传递离子、代谢物质极小的信号分子等的一种通讯方式，从而控制细胞间的协调生长，在细胞增殖、分化、内环境稳定及机体的新陈代谢、生长发育等生理过程中起重要作用。GJIC的通透性主要是靠间隙连接（gap junction，GJ）调节，GJ是浆膜连接复合体的一种类型，不同组织的GJ基本结构相似，但不完全相同，介导细胞间电信号直接传递和相对分子质量小于1000 的亲水性物质的交换，如细胞内的代谢产物、第二信使cAMP、cGMP、Ca2+、1，4，5- 三磷酸肌醇等[1]。GJ的结构单位是连接子，每个连接子又由六个间隙连接蛋白（connexin，Cx，一种膜蛋白）构成六角形亲水半通道，与另一个半通道围绕中央管道排列，相互嵌合，通过微管系统运输传递离子、代谢物质极小的信号分子等，控制细胞间的协调生长，是细胞间进行通讯的物质基础。目前从脊椎动物中至少已分离克隆出21种Cx基因。依据该家族基因编码的蛋白质分子量对各成员进行命名，如Cx26、Cx32等[2]。Cx属于多基因家族，各家族成员的基因序列具有高度同源性，其氨基端及4个跨膜部位氨基酸顺序比较恒定，羧基端存在差异并在不同的组织发挥不同的功能。Cx的表达直接参与了细胞及组织、器官的功能状态，且与肿瘤的发生发展密切相关，在绝大多数恶性肿瘤中表达下调，被认为是抑癌基因[3]。由于Cx家族成员较多，本文仅对研究较多的Cx26（Connexin26） 及Cx32（Connexin32）的结构、功能以及与疾病的关系做一综述。

1 Cx26、Cx32的基因结构

Cx26基因于1993年被克隆，定位13q11-12，全长为4804bp。人类Cx26启动子区域共有6个GC盒、2个GT盒、1个TTAAAA盒、1个NF-kB结合位点、1个金属反应元件、1个乳腺因子结合位点（mammary gland factor，MGF）及1个YY1样结合位点。编码区有678bp，由2个外显子组成，即一个简短的外显子1（exon1，E1）和一个长蛋白编码的外显子2（exon2，E2），编码区主要存在于E2，编码着分子量为26kDa的226个氨基酸的β类缝隙连接蛋白Connexin26（Cx26）[4]。Cx32基因定位于X染色体的Xq13.1，cDNA全长1574bp，包括3个启动子（P1、P2、P3），2个外显子，其中E2包含了整个的开放读码框（ORF）。周围神经中Cx32的转录主要由距E2最近的P2启动，中枢神经系统中转录由P1和P2启动，而在其他组织中则由P1或P3启动，编码着分子量为32kDa的283个氨基酸的β类缝隙连接蛋Connexin32（Cx32）[5]。

2 Cx26、Cx32基因突变与疾病的关系

在人体，Cx26基因编码连接蛋白的E1区是控制细胞离子通道的电压阀门区，其突变可以引起角膜炎、鱼鳞病、耳聋综合征（KID综合征）[6]。Cx26与内耳中钾离子向内淋巴的回流有关，其突变不会导致胚胎死亡而是引起遗传性无综合症耳聋[7]。由于Cx26蛋白的编码序列仅存在于E2，因此很容易通过PCR反应结合测序进行分析。目前有关Cx26基因突变位点的报道已有一百多个，研究目前多集中在遗传性无综合症耳聋，亚洲人主要的突变位点在235delC[8-10]，其机制是使mRNA翻译蛋白质的过程异常。突变后，因移码突变而使DNA的转录提前终止，产生了截短蛋白，经截短后的蛋白丧失了从内质网或高尔基体转运到细胞膜的功能，并同时丧失了寡聚化和稳定的能力，造成了其间隙连接功能的严重退化，导致疾病的发生[4]。

与皮肤病密切相关的Cx26基因突变主要有5种：Vohwinkel 综合征、KID综合征、掌跖角化病、椎状鱼鳞病耳聋、先天性耳聋伴发角质厚皮病和指趾断缩，这些病的共同特征表现为皮肤呈弥漫性角化过度。突变位点位于Cx26胞质的N末端或者第一个细胞外域，第三个跨膜域[11]，及细胞间域等[12]，这些区域的突变使Cx26功能严重损坏[13]，其中最多见的一个突变位点为核苷酸148位G→A，导致连接子（连接蛋白亚单位）的装配与邻近细胞的对接严重障碍，从而影响了表皮分化[14]。

Cx32基因突变致其蛋白结构或功能异常，从而引起细胞间通道缺陷导致疾病的发生。研究已发现Cx32具有维持雪旺氏细胞正常功能的作用，Cx32基因的缺失或突变，均可以引起人和小鼠的遗传性周围神经脱髓鞘疾病，常表现为进行性腓骨肌萎缩症。发现与此症状有关的Cx32突变已达300多例，包括错义突变（氨基酸置换）、无义突变（提前终止密码子）、缺失突变、插入突变和位移突变等多种类型，几乎覆盖了整个编码区。也有文献曾报道过有几例的Cx32基因整个编码序列的缺失导致的缺失突变。已报道的突变中多数是位于基因的开放读码框（ORF），引起相应氨基酸置换可出现在Cx32的胞外区、胞内区和跨膜区，而且很多突变都有多次被报道，但并没有所谓的“热点突变”。启动子P2区域的突变影响启动子活性及与调控因子EGR2的结合力有关，可引起周围神经功能障碍性疾病。有些位点的基因突变能够累及中枢神经系统而引起相应的症状，如TV63I常表现有精神发育迟滞和感觉性神经性耳聋，E186 K的变异则出现有听力损害的临床症状[15-18]。

3 Cx26、Cx32分子结构及功能

Cx家族成员的分子结构基本相同，它们4次跨越胞膜，分为1个氨基端（N末端）、4个跨膜段（M1，M2，M3，M4）、2个胞外段（E1，E2）、1个胞浆连接段（CL）和1个羧基端（C末端）。4个跨膜区都可能参与着连接子的组装过程，细胞外段E1、E2决定了与其他Cx的相容性，胞内连接区和C末端与间隙连接通道pH的调控有关，跨膜区和胞外环高度保守，胞内环和C-端的差异比较大，4个跨膜区都可能参与蛋白的组装过程。不同组织的连接子通过寡聚化在数量和空间上形成不同的组配，从而形成种类各异的GJ。特殊情况下，细胞膜上保持关闭的半通道被激活，调控细胞间离子、胞内代谢产物和信使分子通过，参与细胞间物质交换的代谢藕联和信号传递的电藕联，促进细胞间信息传递交流，维持细胞内环境稳态。GJ的通透性除了与所通过物质的分子量、电荷性质有关，还与Cx翻译后的修饰有关。不同器官组织或同器官不同发育阶段，Cx基因表达种类和强度的不同，都会影响GJIC的通透性。如人胚胎的发育期，Cx26、Cx43在3个月胎龄的肝脏中高表达，Cx32从第5周至第5月呈高表达状态。通道结构的改变使各自的分子选择性也存在差异，在细胞的生长、分化、生理功能的调节中发挥不同的作用。

Cx26在多种上皮组织及内耳中广泛表达，是胚胎发育上皮细胞形成时期最重要的连接蛋白之一。耳蜗的所有细胞的GJ都有Cx26的表达，其中在耳蜗的Corti器表达最强。Cx32是小鼠和大鼠肝组织主要的连接蛋白，也广泛表达在人的肝脏、肾脏、胰腺外分泌部，中枢神经系统的少突胶质细胞、星形胶质细胞及神经元，周围神经的施万细胞以及胃肠道的上皮组织，其表达有直接促进细胞的分化的功能。周围神经系统中，Cx32主要分布在Ranvier氏节和Schmidt-Lanterman切迹，参与施万细胞的间隙连接。

4 Cx26、Cx32与肿瘤的研究进展

4.1 Cx26、 Cx32表达缺失与肿瘤

Cx蛋白表达的异常，常与肿瘤的恶性增殖、转化及某些先天性或遗传性疾病伴随较密切。Cx26和Cx32都是正常器官和组织中发挥功能的连接蛋白，在调控细胞间信息物质的交流，细胞增殖、凋亡及抑制肿瘤细胞的生长和分化方面发挥重要作用。肿瘤组织中普遍存在Cx的异常表达。Cx26是小鼠绒毛膜的合体滋养层细胞转运葡萄糖的必需分子，敲除后小鼠胚胎发育11d后即死亡。鼠的体内和体外大量实验，如利用肝癌细胞系、化学致癌物诱导动物体内肝癌发生以及Cx32敲除技术，也证实细胞膜局在的Cx32所介导的GJIC具有抑制肝癌发生及肝癌细胞增殖的功能[19]。缺失Cx32基因的人和小鼠均则会引起遗传性周围神经脱髓鞘疾病。Cx32在人的肝癌、乳腺癌、肾癌、胃癌等癌组织中也出现表达缺失[20]。Lee等发现Cx26基因在乳腺癌细胞中较正常乳腺上皮细胞表达下调，将带有Cx26的质粒转染到许多肿瘤细胞（包括乳腺癌细胞）后，发现肿瘤细胞的生长明显受到抑制。将Cx26基因转入鼻咽癌细胞系HNE1，Cx26蛋白表达，癌细胞生长抑制，转染的HNE1细胞，克隆形成能力下降，成瘤时间延长，肿瘤生长速度减慢，致瘤能力减弱。Cx26基因转入Cx26表达下调或缺失的肝癌细胞，Cx26蛋白表达恢复，癌细胞生长受抑制，出现了细胞的分化现象，恶性表型在一定程度上得到逆转。可以看出肿瘤细胞恶性表型与Cx的表达降低或消失密切相关，恢复基因的表达，GJIC的功能也在一定程度上恢复。肿瘤组织中可能存在的机制为，缺乏功能性的（通透性）GJIC：多种致癌原因导致GJIC平衡受损，Cx基因发生后天性饰变（如DNA的超甲基化）触发基因的沉默表达，不能正常的转录和翻译，mRNA和蛋白表达缺失，正常细胞与肿瘤细胞不能建立有功能的连接通道，传送生物信息分子（cAMP，IP3）的交流方式被破坏，导致细胞正常的生长调控信息传递受阻，肿瘤细胞增生活跃[20,21]，从而表现为癌变。

4.2 Cx26、 Cx32异位表达与肿瘤

某些肿瘤中存在正常甚至高水平的Cx表达，大部分在细胞胞核或胞质中停留（与黏附分子的表达丧失有关），不再完全正确定位到细胞膜。Gee等研究发现在正常膀胱上皮Cx26基因有一定量的表达，而在癌组织中Cx26基因为表达，但在恶性程度高的膀胱癌中弥漫性表达的百分率较在恶性程度低的膀胱癌中高[22]。Kanczuga-Ko-da等研究了Cx26在结直肠癌中的表达，结果显示Cx26基因主要在癌细胞质中染色，阳性部位主要定位于胞质[23]。肖自安等在喉癌组织中也发现Cx26蛋白和Cx26mRNA不但在细胞膜上有表达，在细胞质中也出现阳性表达，而且明显低于癌旁组织[24]。在肝癌中，也有Cx26消失，Cx32定位于细胞质内的异常表达。分析其可能的机制：异常信号改变了Cx蛋白单体的转运、膜蛋白六聚体形成、通道的结构和电生理特征性，Cx不再转运到达胞膜上形成连接通道，反而聚集于内质网或高尔基体内，出现不适当的磷酸化和胞质的定位错乱，Cx蓄积在细胞质内而在细胞膜表达缺失。导致小分子物质的跨膜转运受阻，影响水、离子或其它信号分子在受累细胞间或细胞内部转运障碍，细胞出现代谢异常，对各种不良应激的敏感性增加，耐受应激能力下降，表现出癌变现象。

研究还发现Cx胞质的异位表达与肿瘤的转移密切相关。Kanczuga-Koda等也证实，细胞质内Cx26过表达与乳腺癌的侵袭和转移密切相关[25]；Cx32过表达促进了乳腺癌细胞的淋巴结转移[26]。Nikolas K等研究Cx与黑色素瘤的关系时发现，在黑色素瘤转移的部位，Cx26、Cx32异位表达于肿瘤周边增生活跃的上皮细胞的胞质中，且与肿瘤的转移程度呈正相关[27,28]。在遗传学改造小鼠的研究中，发现一种转录因子的突变能诱发皮肤Cx26的高表达，干扰幼小动物的皮肤发育和成年动物的皮肤保养及愈合功能，造成皮肤保护性能的缺陷，皮肤被机能亢进的免疫细胞所渗入，这些动物出现了类似人类湿疹和牛皮癣的皮肤炎性疾病[29]。说明Cx的异位表达不仅影响肿瘤的侵袭和转移，或许也参与了调控和影响癌细胞的细胞周期调控、凋亡或者浸润进展的过程，而不是简单的形成GJIC障碍。此时细胞的生长增殖程度不再由GJIC的水平决定，而是与Cx的表达有密切关系。

4.3 GJIC障碍与肿瘤

Cx蛋白本身可以在细胞内在发挥作用，也可以将两个（或多个）细胞（相同或不同类型的细胞）相互结合，构成GJ来交换信息发挥作用。这个组装过程需要一些蛋白分子的参与，研究表明，钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）等可以促使Cx从胞核胞质转运到细胞膜上，形成细胞间GJ传递信息。此外，Cx自身的磷酸化过程也参与着GJ的形成和保持。

在GJ形成的过程，GJIC信号分子的调节中，Cx的磷酸化程度起着重要作用。Cx的C末端可磷酸化的位点有多个，一定程度的磷酸化，有利于细胞GJIC功能的正常发挥，过高过低的磷酸化状态都会抑制GJIC的功能。蛋白激酶（PKC、PKA、PKG）等小分子蛋白被第二信使Ca2+、CAMP激活后，通过识别氨基酸残基上的位点，促进Cx的磷酸化，调节磷酸化的程度，促进mRNA的转录及蛋白的稳定表达，从而影响GJIC的强弱。氨基酸残基磷酸化位点及磷酸化水平的差异，对GJ影响也有差别。此外，研究还发现通过调节细胞表面微绒毛的极化，细胞内成分肌动蛋白的细胞骨架系统也会影响GJIC的形成。癌组织细胞内PK等蛋白对Cx分子的异常调节，可能导致磷酸化位点的改变，抑制mRNA的转录及蛋白的正常表达，进而影响GJIC的功能，引起肿瘤细胞自主性增生[30,31]。研究发现，Cx26、Cx32基因转染HeLa/N2A细胞株，通过激光共聚焦双标显示，Cx26、Cx32在E2-E2连接的部位可以建立有功能的异型通道，并发现N175Y的突变可以引起Cx32定位的改变，Cx26、Cx32连接处被破坏，不再构成有的功能的异型通道[32]；Langlois等报道了在人皮肤鳞癌中Cx43/Cav-1形成的通路的表达量比正常表皮减弱，认为Cx43/Cav-1参与了角质形成细胞向癌细胞转化的病理变化过程[33]。提示Cx的磷酸化位点的变化，Cx的结合能力也在发生变化，GJ也跟着不同的改变，共同参与着机体的病理变化过程。

5 Cx26、 Cx32与肿瘤治疗的研究进展

目前肿瘤治疗的研究策略大多聚焦于以GJIC为靶点的演进阶段的GJIC功能恢复之中。经基因的转染技术后，获得明显效果的有人的膀胱细胞癌、乳腺癌及Hela细胞（通过转染Cx26）等一些肿瘤细胞中，并发现对肿瘤细胞的选择性中，Cx基因有特定的杀伤作用。因此，在肿瘤的基因治疗过程中，应注意抑癌基因Cx基因的特异选择性。此外，应用药物诱导也可增强肿瘤细胞的GJIC功能，如姜黄素、白黎芦醇、类胡萝卜素、表儿茶素、金雀异黄素，绿茶提取物等都有此作用，增强了抗肿瘤药物的敏感性。将Cx26基因转染至鼠的胰腺癌组织中，用抗代谢类抗癌药健择治疗后，Cx26蛋白重新表达，细胞间GJIC功能增强，促进细胞毒性的旁观者效应，诱导肿瘤细胞分化成熟，促进凋亡，使肿瘤体积缩减了50%，证实了Cx26的重新表达可以提高抗癌药健择的药效，抑制肿瘤的形成[34]。总之，使用增强细胞间GJIC的药物是目前比较有前景的一个策略，如果能与肿瘤自杀基因疗法能联合作用与机体，则可能有利于肿瘤的治疗。

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