新城疫病毒诱导产生的抗肿瘤作用相关细胞因子

王 静,卢志红,董尚林,刘开扬

新城疫病毒(Newcastle diease virus,NDV)属禽类副黏病毒科副黏病毒亚科腮腺炎病毒属,NDV的基因组为单股负链RNA,大小约为15～16 kb,包括6种基因,分别用于编码6种病毒的结构蛋白。NDV按其毒力大小可分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株,NDV强毒株是禽类高度感染的致死性病毒,偶尔感染人类,表现为轻微的流感样症状或结膜炎,一般无需治疗,一周左右可自愈。NDV弱毒株能选择性杀伤人和动物的多种肿瘤细胞[1],具有潜在的治疗多种肿瘤的作用,对人无致病力,因此,被广泛应用于各种抗肿瘤研究中。研究证明NDV的抗肿瘤机制有以下几个方面:诱导细胞因子的产生;对免疫细胞的调节作用;其 HN蛋白的抗肿瘤作用以及对肿瘤细胞的选择性杀伤作用。本文重点对NDV诱导宿主细胞分泌的细胞因子及其作用进行综述。

细胞因子是机体抗肿瘤机制的重要组成部分,可在很大程度上改善肿瘤的微环境,在局部可增强特异性 T细胞对肿瘤细胞的免疫应答,增强N K细胞的杀伤活性[2-3]。NDV具有很强的非特异性免疫刺激作用,感染后能够活化宿主细胞,在细胞表面诱导产生白细胞介素(Interleukin,IL)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、干扰素 (Interferon,IFN)、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor,CSF)、一氧化氮等细胞因子和局部趋化因子,这些细胞因子均有直接或间接的抗肿瘤作用,可进一步增强NDV的抗肿瘤功能。

1 白细胞介素(Interleukin,IL)

白细胞介素可由淋巴细胞、单核细胞等多种细胞产生,在细胞间相互作用、免疫调节、造血及炎症过程中发挥着重要作用,并且白细胞介素可以活化淋巴细胞和巨噬细胞,提高机体的免疫功能,从而杀伤肿瘤细胞。研究证明,NDV感染机体后可诱导机体免疫细胞产生的白细胞介素有 IL-1、IL-2、IL-6等,至于NDV感染是否可引起其他种类的白细胞介素的分泌则未见相关报道。

1.1 白细胞介素1 IL-1主要由活化的单核巨噬细胞产生,有IL-1α和 IL-1β两种不同的分子形式。IL-1具有炎症介质的作用,对机体的免疫具有启动、放大效应和正向调节作用,对多种肿瘤细胞的生长具有抑制效应,与 IL-2或干扰素协同可以增强N K细胞活性。早在1997年就有学者[4]给小鼠腹腔接种NDV后,分别在接种后的1 h、2 h、4 h,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测感染NDV小鼠脾脏内细胞因子的mRNA,发现机体在感染NDV 2 h后即可出现 IL-1α和 IL-1β的 mRNA,从而诱导机体产生 IL-1α和 IL-1β,即使使用灭活的NDV,依然可以检测到 IL-1β的分泌。但是当时他们只证实了NDV感染后可以诱导 IL-1的产生,至于产生的IL-1在NDV的抗肿瘤中究竟起到什么作用,其对肿瘤细胞有什么抑制作用,并未做更深入的研究。

1.2 白细胞介素2 IL-2是白介素家族中的重要成员之一、机体免疫调节网络中的核心物质,又被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,TCGF),主要由CD4+和CD8+T细胞产生,可以自分泌或旁分泌方式发挥效应。IL-2可促进 T、B等免疫细胞的增殖分化,增强N K细胞的杀伤活性,诱导LA K细胞生成并促进其活化,另外,IL-2还可促进其他细胞因子如干扰素、肿瘤坏死因子等的分泌以及抗体的产生。此外,有研究发现,IL-2可通过上调Fas受体及抑制Fas相关磷酸酶的表达而促进结肠癌细胞的凋亡[5]。NDV具有诱导生成 IL-2的作用[6],但是直接研究NDV诱导产生的IL-2发挥抗肿瘤作用的报道却为数不多,对于 IL-2的研究,多数学者侧重于导入外源性IL-2基因的重组NDV的抗肿瘤研究,并且取得了一定的进展。将人IL-2基因作为外源基因整合到NDV基因组中,用其感染肿瘤疫苗后,通过肿瘤中和试验,发现可刺激 T细胞发挥抗肿瘤活性,此种效应与不含 IL-2基因的NDV相比显著增强,即NDV固有的免疫刺激作用可以通过引入治疗性的 IL-2基因来进一步的增强[7]。Zamarin D等人[8]将鼠IL-2基因插入NDV基因组中的P基因和M基因之间,构建了表达 IL-2的重组NDV(NDV(F3aa-IL-2)),给C57/BL6小鼠预防性皮下或静脉接种NDV(F3aa株)、NDV(F3aa-IL-2),然后给各组小鼠皮下注射小鼠B16/F10黑色素瘤细胞,成瘤后,分别给荷瘤小鼠瘤内注射 PBS、NDV(F3aa)、NDV(F3aa-IL-2),25 d后PBS组8只小鼠肿瘤显著,NDV(F3aa)组13只小鼠仅有2只小鼠可见肿瘤,但瘤体积明显小于 PBS组,NDV(F3aa-IL-2)组小鼠未检测到肿瘤。此结果说明了与注射 PBS组和注射 NDV(F3aa)组相比,NDV(F3aa-IL-2)有明显的抗小鼠恶性黑色素瘤作用。他们还观察了NDV(F3aa-IL-2)长期的抗肿瘤效应,发现表达 IL-2的重组 NDV(NDV(F3aa-IL-2)),可显著提高小鼠的总体生存率(与 PBS对照组相比P=0.0002,与 NDV(F3aa)组相比P=0.0498)。

1.3 白细胞介素6 IL-6是机体免疫网络中最重要的细胞因子之一,主要由单核巨噬细胞分泌,部分来自于 T细胞、B细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。在天然情况下,IL-6可以通过旁分泌和自分泌形式在局部发挥作用,但是在某些病理情况下,如急性炎症时,也可通过内分泌形式在全身发挥作用。IL-6有着非常复杂的生物学功能,可通过影响细胞的粘附性、活动力、血栓形成、肿瘤特异性抗原的表达及肿瘤细胞的增殖而影响肿瘤的进展[9]。IL-6对肿瘤的生长有双向调节作用,可根据肿瘤细胞的类型及其表面是否有IL-6受体,表现为抑制或促进肿瘤细胞的增殖。对前列腺癌细胞,IL-6可通过激活JA K-STA T3信号传导通路实现对其生长的抑制作用[10]。对颈部肿瘤IL-6可通过激活VEGF-A介导的血管新生促进其生长[11]。有研究证明了NDV可以诱导机体免疫细胞分泌 IL-6[4,12],那么,NDV诱导分泌的IL-6对肿瘤细胞究竟是抑制还是促进呢?有关此类研究的报道较少。张琪等人通过构建S37肿瘤鼠模型,用 HE染色和免疫组化的方法对NDV治疗肿瘤时瘤组织中IL-6的动态表达进行了研究,发现在肿瘤组织坏死区,IL-6表达很弱甚至不表达,而在生长旺盛的肿瘤组织,治疗组IL-6表达呈强阳性。治疗组 IL-6的表达随着肿瘤组织的变化,呈现由阳性到强阳性再到阳性的变化,这表明了NDV在治疗肿瘤的过程中,能促使机体产生大量的细胞因子参与机体的抑瘤作用,并且有可能参与了肿瘤细胞的坏死及凋亡过程[13]。

2 肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)

TNF具有抗炎、抗休克、抗肿瘤等多种生物学活性[14],TNF通过与靶细胞膜上的TNF受体结合后,可激发细胞内的一系列信号传递,引起钙离子浓度增加,激活核酸内切酶,导致DNA降解、细胞凋亡。TNF抗肿瘤机制主要有对肿瘤细胞的直接毒性、对肿瘤血管结构效应及宿主抗肿瘤机制的激活等几个方面。TNF有两种类型 TNF-α和 TNF-β。TNF-α是由被激活的巨噬细胞产生的有多种活性的多肽类细胞因子,是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的生物因子,是宿主的重要防卫机制之一[15-16],TNF-α的抗肿瘤作用主要表现在诱导肿瘤细胞凋亡、破坏肿瘤组织血管、放化疗免疫增敏作用、介导免疫调节作用等。TNF-β又称为淋巴毒素(lymphotoxin,L T),由活化的 T细胞和N K细胞产生,它与 TNF-α有结构上的同源性和功能上的相似性,TNF-β能杀死某些肿瘤细胞或者抑制其增殖,其机制可能是直接杀伤或抑制肿瘤细胞、调节机体免疫功能、损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱,造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死[17]。对于NDV诱导 TNF-β分泌并发挥抗肿瘤效应的报道较少,大量文献表明 NDV可以诱导TNF-α的产生并发挥抗肿瘤效应。Huang C等人[18]通过构建人结肠癌裸鼠移植瘤模型研究NDV D817毒株的抗肿瘤效应,采用NDV D817高、中、低三个剂量,观察不同剂量NDV D817对移植瘤的抑制作用,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测荷瘤小鼠体内 TNF-α的含量,结果发现中剂量NDV D817可明显抑制移植瘤的生长,抑制率达48.1%,NDV D817具有诱导肿瘤细胞凋亡和诱导机体产生 TNF-α的作用。但是NDV D817诱导肿瘤细胞凋亡是否与诱导 TNF-α产生有关,并未进一步研究。白莲花等人用新城疫病毒L系(NDV-L)作用于小鼠腹腔巨噬细胞 PEMФ,结果发现NDVL可诱导小鼠 PEMФ产生 TNF-α,并且产生 TNF-α的量与NDV-L作用的时间和剂量有一定的关系,当NDV-L感染剂量一定时 TNF-α的释放量在NDV-L作用24h时最强。用3H-脱氧胸苷(3HTdR)标记肿瘤细胞做 TNF-α的细胞毒实验,表明其具有明显的杀伤活性。将NDV-L处理的PEMФ静脉转输给B16黑色素瘤荷瘤小鼠,发现对肺转移有明显的抑制作用(P<0.01)。此项研究说明了NDV-L可以诱导小鼠 PEMФ产生 TNF-α,并且产生的 TNF-α具有明显的细胞毒作用,在体内具有明显的抑制肺转移的作用[19-20]。NDV不仅可以诱导人单核细胞产生 TNF-α,并且其感染肿瘤细胞后能增强肿瘤细胞对 TNF-α溶细胞效应的敏感性[21]。

3 干扰素(Interferon,IFN)

干扰素是一类具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用[22]的细胞因子,也是最先被发现、最早被应用于临床的细胞因子。依据其来源、受体、应答途径和效应的不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型干扰素:IFN可以通过促进机体免疫细胞功能,提高巨噬细胞、N K细胞以及细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)的杀伤能力来发挥其抗肿瘤作用。NDV可以诱导IFN-α、IFN-β、IFN-γ的产生[4,23-24],并且即使无复制活性的NDV也可以使人外周血单核细胞分泌 IFN-α增加[25]。IFN-α的抗肿瘤机制主要有直接作用于肿瘤细胞和间接调节免疫功能两个方面,间接调节免疫功能的主要途径就是促进肿瘤坏死因子家族介导的细胞凋亡。IFN-α可以通过激活JA K-STA T途径诱导 TRAIL(TNF-related Apoptosis-inducing Ligand)等分子的表达,还可以增强 FasL表达,TRAIL与FasL与肿瘤细胞表面的相应受体结合后,通过信号转导可以启动caspase级联反应,最终裂解核蛋白、细胞骨架、内质网等诱导肿瘤细胞凋亡。另外,IFN-α还可在转录水平增强 P53[26]、Bax[27]等凋亡相关基因的表达,来增强它的抗肿瘤功能。NDV具有强大的 IFN-β诱生能力,陈辉等人[28]选用3株人肝细胞系 PH5CH8、Huh7、Hep G2作为研究对象,使用NDV与多聚次黄苷酸-胞苷酸〔poly(I:C)〕作为 IFN-β诱生剂处理上述3种细胞,从转录、蛋白水平及功能学角度检测产生 IFN-β的能力。结果显示,PH5CH8细胞经NDV诱导后,IFN-β水平升高了327.20倍。IFN-γ则可以通过直接抑制肿瘤细胞、增强宿主对肿瘤细胞的免疫反应等途径干扰宿主与肿瘤间的相互关系等方面来发挥抗肿瘤作用[29]。另外,IFN-γ还可以通过抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤转移[30]。IFN与IL-2、TNF具有相互协同促进作用,IL-2诱导N K细胞活化增殖后可引起 TNF和 IFN-γ的释放,TNF和肿瘤细胞膜上的TNF受体结合后可以直接或间接破坏肿瘤细胞,IFN能上调肿瘤细胞表面的 TNF受体的表达而协同 TNF抗肿瘤,IFN与IL-2、TNF均可促进FasL的表达,而FasL与靶细胞表面上的 Fas分子相互作用,启动信号传导过程,导致靶细胞内源性自杀程序激活,是诱导靶细胞凋亡的主要途径之一。NDV诱导产生的IFN、IL-2与 TNF是否可以通过此途径协同作用来间接促进NDV的抗肿瘤作用,仍然需要我们进一步的研究。

4 集落刺激因子 (Colony Stimulating Factor,CSF)

集落刺激因子是指能够刺激多能造血干细胞和不同发育分化阶段的造血干细胞进行增殖分化,并在半固体培养基中形成相应集落的细胞因子。集落刺激因子种类繁多,包括巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-CSF,M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-csf,G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多重集落刺激因子(multi-CSF,即IL-3)、干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)、红细胞生成素(erythropoietin,EPO)以及血小板生成素(thrombopoietin,TPO)等。将外源性 GMCSF基因导入肿瘤细胞中可以促进APC的成熟,并且提高其对肿瘤抗原的递呈和加工处理能力[31,32]。NDV可以诱导 GM-CSF和M-CSF的分泌[4],并且NDV的固有抗肿瘤作用和免疫刺激作用可以通过引入外源性的 GM-CSF基因来进一步的增强,同时伴随着IFN-α的分泌量显著增加[33]。

5 一氧化氮(Nitric Oxide,NO)

NO是生物体内一种结构简单的自由基,是机体内重要的信使分子和效应分子,具有重要的生理功能,在杀伤肿瘤方面有重要意义,是活化的巨噬细胞杀伤肿瘤细胞时产生的毒性效应因子之一。对于NDV可以诱导NO分泌以及诱导分泌的NO的抗肿瘤作用,国内外许多学者分别从体外、体内等方面进行了大量的研究。Umansky等人[34]在体外实验中发现NDV作用人的外周血单核细胞后产生NO,释放出来的NO与NDV杀伤肿瘤细胞有密切的关系,NO可导致巨噬细胞核的NF-κB因子活化,从而活化巨噬细胞。将NDV-L作用于人外周血粘附性单个核细胞(a-PBMCs)2～4 h后,可发现NDV-L相对稳定地吸附在其表面,并诱导其释放一氧化氮,而且NO的释放量与病毒滴度有关,当病毒滴度在10-6～10-9时,NO的分泌量维持在一个相对稳定的高水平。使用3H-TdR释放法测定NDV-L作用的a-PBMCs对 K562细胞的细胞毒活性,发现具有明显的杀伤效应,并且杀伤效应与NO的产生有一定的依赖性[35]。Schirrmacher U等人[36]使用2种不同的NDV毒株、不同来源的巨噬细胞、不同的鼠系(DBA/2,C57BL/6,615)在不同的条件下研究NDV体内外激活鼠巨噬细胞的抗肿瘤活性的能力时,发现有抗肿瘤作用的效应物质如NO、TNF-α的产生。

6 其他细胞因子和趋化因子

唐省三等人以人膀胱癌EJ细胞株为靶细胞,研究NDV对体外肿瘤细胞的抑制作用机制时,使用免疫组化的方法检测到 TGF-β1表达增加,TGF-β1与其受体或抑制成分结合蛋白结合而诱导膀胱癌细胞凋亡[37]。

NDV具有诱导 T细胞共刺激活性、防止无能诱导以及诱导局部趋化因子如RAN TES、IP10等的作用,T细胞通过趋化因子聚集于接种局部,导致肿瘤特异性 T淋巴细胞活化,此种特异性 T淋巴细胞有两型,一是记忆细胞,另一是初始 T细胞,此两种细胞活化后产生肿瘤特异性记忆 T细胞,重新参与体循环,再一次接触肿瘤相关抗原。就可以通过介导细胞因子和趋化因子的产生而诱导局部抗肿瘤免疫反应,新产生的这些因子又可以进一步聚集其他 T细胞,最终消灭肿瘤细胞[38]。

综上所述,NDV诱导分泌的抗肿瘤作用相关细胞因子种类繁多,它们之间的关系也很复杂,我们知道,细胞因子发挥作用具有多效性和重叠性的特点,而且不同细胞因子之间具有协同和拮抗的作用,其合成和分泌相互调节,受体表达相互调控,共同组成了复杂的细胞因子网络来发挥其作用。如文中所述,IFN与IL-2、TNF具有相互协同促进作用:IL-2可以促进干扰素、肿瘤坏死因子等的分泌,IFN能上调肿瘤细胞表面的 TNF受体的表达而协同 TNF抗肿瘤,另外,IFN与 IL-2、TNF均可上调 FasL的表达,细胞因子之间通过这种互相协同促进作用可使其抗肿瘤效能进一步放大。但是,NDV诱导产生的众多细胞因子之间具有什么协同或拮抗的作用呢?目前此类的研究较少,关于NDV诱导细胞因子的研究主要是研究NDV诱导某种或某几种细胞因子后的抗肿瘤作用观察,或者是NDV与某些细胞因子联合应用后的抗肿瘤效果对比。

7 问题与展望

NDV抗癌活性显著,目前很多人致力于研究NDV的抗肿瘤机制,但是从NDV诱导细胞因子的角度来观察其抗肿瘤作用的研究却为数不多。而且就目前的研究形势来看,针对NDV诱导产生某一种或几种细胞因子后的抗肿瘤作用的研究较为常见,对NDV诱导产生的众多细胞因子抗肿瘤途径的研究则为数不多,特别是对这些细胞因子之间的联系、协同作用的研究非常有限。所以至今我们对NDV诱导产生的众多细胞因子之间的相互作用、信号转导以及它们是如何系统地完成整个抗肿瘤过程的,仍然缺乏一个完整的认识。NDV诱导产生的众多细胞因子之间有何关联?它们之间是如何协同或拮抗的?它们在NDV抗肿瘤机制中到底扮演了一个什么角色?以及还有没有我们没有发现的NDV诱导的抗肿瘤相关细胞因子?这些问题仍然需要我们进一步的研究。

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