甲型H1N1流感血清流行病学研究进展

郑奎城,沈晓娜,杨式芹,林元波,周朝晖,谢剑锋,陈 炜,翁育伟,严延生

2.福建医科大学,福州 350004;

3.福建省实验动物质量检测中心重点实验室,福州350001

甲型H1N1流感(甲流)病毒是4源重配病毒,由经典猪流感病毒、欧洲猪流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒重配而成,人群对甲流病毒普遍易感。2009年6月11日,世界卫生组织(WHO)宣布将甲流流行警告级别提升为6级,全球进入流感大流行阶段。2010年8月10日,WHO宣布进入甲流大流行后时期 。根据WHO公布的数据,在这段时间甲流疫情波及的国家和地区达到214个,死亡病例超过18 449人[1]。根据以往大流行的经验,WHO预计甲流病毒还会以季节性流感病毒的表现方式出现,并在今后若干年内继续传播,病毒很有可能继续使年轻人群发生严重疾病。各国须继续对此保持警惕。因此,很有必要依据疾病监测报告或血清学监测估计和预测甲流在世界各地的流行强度。虽然甲流在全球广泛流行,但由于大量轻症患者和隐性感染的存在,疾病监测系统报告的确诊病例不能反映疫情实际情况,而血清流行病学调查方法更适合于调查不同时间节点、不同地区、不同年龄段人群的感染水平及动态变化趋势。根据文献报道,对于确定甲流的感染率,血清学监测的敏感度是临床病例监测的10倍以上[2]。目前甲流血清学研究以血凝抑制试验(HI)、微量中和试验(NT)为主,两者都可以用来估计甲流流行后人群的感染率,但均有优劣点,以下对其研究进展作一略述。

1 血凝抑制试验方法(HI)

流感病毒能够与豚鼠、鸡红细胞或人O型红细胞发生凝集,即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制现象。其原理是相应的抗体与病毒结合后,阻抑了病毒表面的血凝素与红细胞表面受体的结合。血凝抑制试验(HI)是目前最常用的鉴定流感病毒及流感病毒型别的方法。HI长期以来被用作流感病毒感染,疫苗评价,疫苗株筛选的血清学检验方法。该方法简单、易行、结果可靠。

1.1 红细胞种类对HI敏感性的影响 HI的敏感性受到所使用的红细胞种类的影响。Stephsen指出在检测H5N1高致病性禽流感HI抗体时马红细胞比火鸡红细胞更敏感[3]。在Lerdsmran的研究中,为了确定以鹅红细胞和火鸡红细胞为凝集细胞的HI试验是否得到可比的HI抗体滴度,6名科学家以HI抗体几何平均滴度为1∶183的人血清为参照,以鹅红细胞和火鸡红细胞进行平行实验。结果表明无论是鹅红细胞或火鸡红细胞,6人得出的HI抗体滴度都为1∶160[4]。进一步对53名甲流患者的急性期和恢复期的双份血清及100名健康医务人员的单份血清进行平行实验,结果表明以鹅红细胞和以火鸡红细胞的HI试验,两者HI抗体滴度的相关系数达0.96(Spearman's rank,P＜0.01)。HI抗体滴度≥1∶40的人数、恢复期与急性期抗体滴度比、抗体滴度呈4倍以上增长的人数都相似,而且结果还显示鹅红细胞的血凝样式比火鸡的更清晰。基于鹅红细胞和火鸡红细胞的HI抗体滴度有可比性,而且在东亚和东南亚地区鹅比火鸡更易获得,所以开展HI试验时,可用鹅红细胞代替火鸡红细胞。

1.2 HI抗体阳性临界值 许多研究者以HI抗体≥1∶40作为判断甲流感染的临界值(cut-off value),并以此估计人群的感染率[2,5]。这个临界值的设定是根据WHO指南,即当流感HI抗体≥1∶40时,人群中50%的人具有保护性抗体水平[6]。然而,Lerdsmran指出,7.5%的甲流患者恢复期血清HI抗体＜1∶40[4]。与此类似,Chen报道在甲流患者发病后的第25至29 d之间,7%的患者其HI抗体＜1∶40[5]。Miller等指出,在55名甲流确诊患者中有6名(10.9%)HI抗体滴度低于1∶32[2]。这些结果提示若以HI抗体滴度≥1∶40衡量甲流的感染情况,可能会低估实际的感染水平。进一步分析显示,成人和低龄儿童HI抗体产生水平并不一致,应以不同的HI抗体阳性临界值来判断是否感染甲流。故在 Lerdsmran的研究中,以HI抗体≥1∶20作为低龄儿童的阳性临界值,而以HI抗体≥1∶40作为成人的阳性临界值[4]。

1.3 HI抗体与交叉反应 甲流流行前人群是否具有一定的交叉反应抗体,以及季节性流感疫苗对甲流病毒是否有交叉保护作用是倍受争议的问题。在Lerdsmran的研究中,对71名已接种了季节性流感疫苗对象的血清进行甲流病毒HI试验,发现有8名(11.3%)HI抗体滴度在 1∶10至≥1∶40之间,其中有1(1.4%)名 HI抗体滴度为1∶80[4]。同样,Hancock指出在2007-2009年期间注射三价灭活季节性流感疫苗的成人中,有7%的人其甲流HI抗体呈现4倍或以上增长。然而,Kelly则指出,季节性流感疫苗对甲流无保护作用[7],但亦有其他研究者报道季节性流感疫苗对甲流有部分保护作用[8]。

有学者报道,由于既往的季节性流感暴露或疫苗接种,老年人甲流抗体呈较高水平,美国疾控中心也发现甲流流行前≥60岁年龄组HI抗体阳性率在各年龄组中水平最高[9]。Hancock在报告中指出,在1980年后出生的107名对象中有4人(3.7%)其甲流HI抗体≥1∶40,而1950年前出生的115人中有39人(34%)甲流HI抗体≥1∶80。我国江苏省曾检测在2008年11月甲流流行前采集的632份血清,发现有3.64%能检出甲流HI保护性抗体(≥1∶40)[10]。而我们先前的报告指出,在2008年人群甲流HI抗体≥1∶10和≥1∶40的阳性率分别为6.5%和0.63%[11]。这些结果显示,自然人群在甲流流行前存在着一定的交叉反应抗体,可能与感染猪流感病毒或其它具有抗原交叉性的H1N1亚型流感病毒有关。但迄今为止,国内监测尚未发现类似国外报道的高年龄组人群在甲流流行前具有较高HI抗体阳性率现象,这可能与甲流流行前我国流感疫苗接种率显著低于国外有关。

1.4 HI抗体的消长 甲流患者或甲流疫苗接种者的HI抗体消长的相关研究还不多,但Wang在其近期的报告中指出,甲流患者在发病后的第15 d,HI抗体≥1∶40的比例从发病前的0%上升到60%,第30 d达到 100%,但在第 180 d下降为52%;而接种单价裂解甲流疫苗的人群HI抗体≥1∶40的比例则为：在接种后的第15 d从接种前的0%上升为78%,第30 d达到81%,第180 d则降为34%[12]。甲流患者在发病后的第15 d和第30 d,其HI抗体的几何平均滴度(GMT)无显著变化,但在第180 d GMT则从第30 d的1∶80下降为1∶52。然而,接种疫苗的对象,其GMT在第15 d为1∶100,在第30 d上升为1∶193,但在第180 d则下降为1∶74。这些结果显示,与甲流患者相比,疫苗接种者的HI抗体阳转率低,但GMT却显著高而且持续时间相对较长。无论是经自然感染还是通过接种疫苗获得保护性抗体,在6个月之后约一半的调查对象丧失了抵抗甲流再次感染的免疫力。

1.5 HI抗体调查的影响因素 以血清学方法估计人群的甲流感染率受到几个混杂因子的影响,如由于接种季节性流感疫苗引起的交叉反应,或由于人体内存在1957年流感病毒的抗体等。此外,年龄是甲流HI抗体阳性率的独立相关因素。我们先前的报告也指出,在甲流流行后的各年龄组之间,无论是HI抗体≥1∶40的率还是 GMT值,均以6～17岁为最高,18～55岁次之,再次为≥56岁,而0～5岁为最低,而且各年龄组之间的差异都有统计学意义,表明年龄是影响甲流HI抗体水平的因素之一[11]。这与甲流病例的分布主要以年轻人群为主相吻合。但不同性别之间抗体阳性率差异无统计学意义,表明不同性别人群甲流的易感性和感染风险类似[10,13]。

2 中和抗体试验

病毒中和抗体试验(NT)是敏感而特异的血清学方法,可直接评价血清对病毒的中和保护能力,是检测抗体与病毒作用的经典方法。其基本原理为血清中的特异抗体与病毒的表面抗原相结合,使病毒失去感染宿主细胞的能力,从而抑制细胞病变的产生。由于中和抗体在血清中维持时间长,不能仅凭中和试验为阳性结果,作为判断是否有相应病毒感染的依据。

2.1 血清前处理对NT试验的影响 在开展甲流的血清流行病学研究时,许多实验室以NT试验作为HI试验的附加试验。在HI试验中,通常以霍乱菌液(RDE)对血清进行前处理以去除血清的非特异抑制因子,但在常规NT试验中,一般未对血清以RDE进行前处理[2]。Lerdsmran的结果显示,对于无甲流HI抗体的血清,如未采取RDE处理,其NT抗体的GMT异常高,但在以RDE处理后,NT抗体的GM T与HI抗体的GM T具有可比性[4]。提示血清中的非特异抑制因子不仅能使HI试验产生假阳性结果,也能使NT试验出现假阳性结果。因此,建议在以NT试验检测甲流抗体时,增加 RDE前处理步骤。

2.2 NT抗体与HI抗体的可比性 Lerdsmran对甲流患者发病后54 d内,每隔5 d检测一次血清HI抗体和 NT抗体,两种抗体的相关系数为 0.85(Spearman's rank,P＜0.0001)。HI抗体和NT抗体都呈4倍增长最早出现在甲流发病后的第11d。在低年龄组患者中,HI≥1∶20为 100%,≥1∶40为86.1%,而NT 抗体≥1∶20为97.2%,≥1∶40为94.4%。在 44名成人患者中有 43名(97.7%)恢复期血清 HI≥1∶40,而 100%患者的NT抗体均≥1∶80。Grund等采集43名健康对象在接种甲流疫苗前与接种后第21 d的双份血清,以NT试验与HI试验检测其抗体水平。结果显示,第二份血清NT抗体和HI抗体呈4倍增长的比例均为95.3%,而且两种抗体的GMT及其增长幅度都呈很好的可比性[13]。这些结果表明,NT试验在评价甲流感染后或疫苗接种后抗体的水平变化与HI试验有良好的可比性。

2.3 NT抗体与交叉反应 Hancock指出,在接种季节性流感疫苗的成人中有7%的人其甲流HI抗体呈现4倍或以上增长,而甲流NT抗体阳性率(≥1∶40)则高达22%[9]。Lerdsmran[4]也指出,在已接种了季节性流感疫苗的对象中,有11.3%的人其HI抗体在1∶10至≥1∶40之间,有1.4%的人高于1∶80,而NT抗体≥1∶40的比例则高达22.5%。Mark等在香港开展的血清学调查中发现,在≥65岁以上年龄组人群中,有37%的人在甲流大流行前其NT抗体≥1∶40[14]。说明与HI抗体相比,甲流NT抗体与季节性流感的交叉反应更广。

由于HI抗体仅与流感病毒的血凝素受体结合,而NT抗体可与更广范围的病毒受体结合,所以相对于 HI抗体而言,NT抗体反应更广、更敏感[15-16],正由于这个特点,甲流NT抗体与季节性流感病毒或疫苗的交叉反应显得更高,特别是在50岁以上的接种疫苗者中,其血清NT抗体显示出高度交叉反应[4,9,13]。此外,NT抗体在血清中维持时间长,因此,若以NT抗体≥1∶40作为判断甲流感染的临界值,并以此估计人群的感染率,可能会导致感染率的高估。所以,甲流NT抗体阳性临界值的设定,还须进一步研究,以准确评估甲流的感染率。

3 展 望

目前甲流病毒以季节性流感病毒的表现方式出现,在某些地区形成一定规模的流行,依然威胁人们的健康。血清流行病学研究可以准确监测和预测甲流在不同时间节点、不同地区、不同年龄组人群的感染水平及动态变化趋势。除了HI和 NT试验以外,酶免疫实验法(EIA)和以ELISA为基础的微量NT试验也逐步得以应用,这些方法更便捷快速,但其敏感度和特异度仍有待进一步探讨。

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