神经组织染色方法的研究概况

顾 兵，金建波，李华南，王烁宇

(1.江西科技师范学院，江西 南昌 330013;2.江西中医学院，江西南昌 330006)

神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)是由大脑或脊髓的神经元或其髓鞘的丧失所致，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍［1］。采用常规染色技术，如HE染色，疾病的某些特殊病理变化难以完全准确的显现，而借助一些特殊染色可对某一特定结构改变进行选择性的浸染。但是，由于后者染色步骤过于复杂，流程相对繁琐，受外界因素的干扰比较大，经常导致染色结果的不稳定，进而难以反映病理改变。目前，系统介绍神经组织染色技术进展的文献甚少，使得神经病理学研究人员，尤其是初学者，难以领会各种染色方法的精髓。根据浸染组织的不同，将神经组织染色分为尼氏染色、神经元染色、神经胶质细胞染色、髓鞘染色、突触染色和神经纤维染色6种。本文就发展成熟的神经组织染色方法原理、优缺点及其病理学应用作一综述，并简述其在神经退行性疾病研究中的应用，旨在指导研究者选用合适的染色方法。

1 尼氏染色(Nissl staining)

尼氏染色方法是德国病理学家Nissl于1892年创立，其主要根据是神经元胞体内含有大量嗜碱性的尼氏小体。当组织与某些碱性染料(甲粉紫、甲苯胺蓝、硫堇、焦油紫等)作用时，细胞中的尼氏体能够选择性与其结合而着色。Lindroos［2］对尼氏染色方法进行了改良，并应用于颅脑组织切片的病理研究。改良后的方法大大缩短了染色时间，且胞内细胞核，尼氏体均能清晰可见。虽然尼氏染色法既可清晰辨别尼氏体以及胞核、核仁［3］，又很容易区分轴突和树突，但该法仅应用于脑，脊髓等尼氏体较为丰富的组织。尼氏体受染后呈块状(形如虎斑)或颗粒状，核周围尼氏体颗粒较大，近边缘处较小而细长。在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失，因此根据形状大小和数量差异，可判别神经损伤程度。Simon等［4］报道促红细胞生成素对猪缺血/再灌注损伤的治疗作用。经尼氏染色、HE染色和TUNEL免疫组化染色证实，脊髓胸段神经元损伤以及凋亡得到缓解。Pinzon等［5］分别采用动物行为学和尼氏染色评价二甲胺四环素对脊髓挫伤大鼠的神经保护作用。施用二甲胺四环素后，大鼠BBB评分和组织病理学均有改善。缺点是组织未干燥完全，易发生严重皱缩。其次，切片之后易使组织破裂，影响观察。

2 神经元染色(neuron staining)

神经元染色主要分为镀银染色和FJ染色(Fluoro jade staining)两种方法。镀银染色是由Golgi于1873年建立并成功应用于神经元的特异性染色技术。由于神经元具有较强的嗜银性，当组织处于含有银离子的溶液中，神经元可选择性地浸染银离子。然后通过甲醛溶液可将沉积在组织中的银离子还原为银颗粒，从而使神经元着色。但是，Golgi法只能浸染所有神经元细胞，难以辨别溃变的神经元。Carlsen等［6］发现组织切片经过铜银溶液浸染后，正常神经元被抑制染色，从而区分出溃变神经元，且染色结果背景清晰，溃变神经元及其轴突结构完整。Tenkova等［7］在此基础上对镀银染色进行了改进，使组织切片在4%多聚甲醛溶液中保存时间延长至6个月，仍具较好染色效果，染色结果背景呈金黄色。因而，该方法在神经退行性疾病研究方面被诸多学者所亲睐。Hall等［8］利用铜银染色技术对控制性皮层撞击小鼠进行定量影像分析，同时对神经元退变程度的空间性和时程性作了比较完整的阐述。Macauley等［9］报道了PPT1(一种棕榈蛋白质硫酯酶)缺陷小鼠的小脑病理和运动障碍的结果。经过铜银染色后，发现PPT1缺失后大鼠神经元退变程度明显增加。但由于试剂成本较高，染色步骤较为繁琐，耗时较长，不宜批量制作标本，并且所需器皿均需洁净，否则影响染色结果。此外该染色技术通常采用多聚甲醛溶液及二甲胂酸缓冲液对标本进行灌注固定，且固定时间均需完全，否则神经元不易被浸染或浸染不完全［10］，因此国内报道较少。

FJ染色是近年来新兴的一种神经元染色技术［11］。Fluoro Jade染料对变性神经元具有很高亲和力，在紫外线照射条件下，坏死神经元显现蓝色荧光，由此对损伤神经元进行定性，定量研究。FJ染色不仅可选择性地标记脑及脊髓组织切片上变性神经元的胞体、树突和轴突，而且能显示脑内神经细胞凋亡和组织中淀粉样蛋白沉积。FJ染色除了能浸染溃变神经元外，还可以用于退变有髓纤维束的追踪，如视神经束等。目前用于退变神经元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三种。与FJ和 FJB染料相比［12］，FJC染料效果更优，亲和力更高，染色时间短，所需浓度低。此外，其还可与其它荧光素标记物结合进行多重荧光染色。Chidlow等［13］采用FJC和DAPI(一种能够与DNA强力结合的荧光染料)荧光双染技术评价大鼠视网膜和视神经纤维损伤后神经元退变情况。Mechírová 等［14］探讨脊髓缺血/再灌注后神经元退变，试验前预先施用去甲肾上腺素和银杏叶乙醇提取物EGb761的家兔，FJB染色结果发现缺血/再灌注后大鼠脊髓侧角Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ对阳性神经元明显下降。

3 神经胶质细胞染色(Glial staining)

3.1 星形胶质细胞 Cajal法染色是一种选择性浸染星形胶质细胞的染色技术。原理是切片经氯化金升汞溶液浸染，然后通过亚硫酸钠溶液使星形胶质细胞着色稳定。缺点是染液需临用前配制，不易保存，染色耗时长，染色结果不稳定。Kitch等［15］建立的星形胶质细胞染色方法，能选择性地浸染原生质型或纤维型星形胶质细胞的胞体，而对其他胶质细胞的浸染具有抑制作用。但对于Ⅱ型阿尔采末病引起的星形胶质细胞病变状态难以浸染。杨壮来在Cajal法染色的基础上对组织的切片，固定，浸染等步骤进行了修改。改良后的方法使纤维型星形胶质细胞染色均匀，背景浅，染色时间明显缩短。许多神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔采末病，常与脑内神经细胞，尤其是星形胶质细胞的损伤(或退化)，脑中神经纤维丛的出现以及类淀粉斑有关。邓广斐等采用将神经毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森病动物模型。经碳酸银染色发现，帕金森病模型组星形胶质细胞增生与激活明显。

3.2 小胶质细胞 1963年Naoumenko等报道采用碳酸银法浸染小胶质细胞，再经过甲醛溶液还原使银沉积在组织切片上。与常规HE染色相比，碳酸银染色能够显现出胞体及其突起。但碳酸银见光易分解，不易保存。但后来Gallyas报道的银染法具有组织可于甲醛溶液中保存数年，适用于多种标本的取材，包括冰冻切片、石蜡切片等，可批量进行染色操作，浸染过程可在镜下操作便于控制染色时间等优点。郑翔等将组织标本由原来的火棉胶处理改为石蜡处理。虽然准确稳定的浸染出小胶质细胞，但仍存在一些缺陷，如切片厚度不能太厚，背景过深等。于腾波等探讨活化的小胶质细胞移植治疗大鼠脊髓中度损伤的疗效。碳酸银染色和BBB评分结果显示:移植组比同期对照组阳性细胞数明显增多，移植组术后后肢运动功能评分较对照组明显升高。

3.3 少突胶质细胞 少突胶质细胞染色原理与其他镀银染色技术相类似，主要依据神经细胞嗜银性。1930年Penfield采用Del Rio-Hortega’s改良法成功浸染出少突胶质细胞。该法对脊髓，脑干及颅脑白质区域的少突胶质细胞浸染可靠性好，并且还可选择性浸染外周神经施万细胞的髓鞘，但染色背景较粗糙，影响观察。1948年Grino等将钨酸钠添加至硝酸银溶液中，使少突胶质细胞的呈现更为清楚。少突胶质细胞对氧具有特殊的亲和力，经过过氧化氢溶液处理后，激活了少突胶质细胞内的碳酼基而发生显色反应。但此法对于细胞突起的显示不够清晰，操作比较繁琐。姚竹秀将Grino法进行改进，采用Peufield染色法所用的固定剂固定组织，得到较好的染色结果，并认为固定剂成分和酸碱度对染色的成败大有关系。马廷贤将银溶液中的碳酸钠浓度调至饱和，用DAB和H2O2对切片进行预处理，同时把浸染的时间延长和温度升高，染色结果稳定性和成功率大为提高。细胞形态显现的原因可能是DAB对银离子具有吸附作用，使其在胶质细胞的胞体和突起上沉积而显色。

4 髓鞘染色(myelin staining)

髓鞘是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜。神经纤维受损时，如多发性硬化症，脑脊髓炎等疾病均可导致髓鞘的变形，崩解或脱失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法，利用锇酸与类脂质的特殊反应和油溶性染料浸染法3种。媒染法主要是因为经铬盐或铁矾媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易与苏木素结合而着色，具有操作简单，试剂便宜的优点。但染色结果对比度差、且分化不易掌控，较难被初学者所掌握。锇酸与类脂质的特殊反应主要原理是:将类脂质组织(磷脂)固定于锇酸溶液后，能被氧化成黑色体，由此特异性鉴别髓鞘。经锇酸固定后的类脂质组织不会被脂溶性溶剂溶解，提高了结果准确性。但锇酸价格昂贵，且不易久存;其次因浸透性差，经常造成组织背景模糊，不易观察。油溶性染料主要是指Luxol固蓝，是Kluver等［16］于1953年将其应用于髓鞘染色。Luxol固蓝在乙醇溶液内具有与髓鞘磷脂结合染色的特性，如再经过中性红或焦油紫复染，不仅对髓鞘着色有一定的强化效应，而且还可浸染神经元的胞核及尼氏体。Luxol固蓝染色能够浸染髓鞘束和单一髓鞘纤维，髓鞘着色鲜明，背景清晰。吕广明认为该法对于鉴定神经髓鞘的特异性具有良好的标记作用，常用于显示髓鞘含量丰富的神经传导束，如皮质脊髓束。此外，也可用来分析髓鞘再生及脱髓鞘的程度［17］。与媒染法、锇酸染色法相比，对比度明显提高，特异性好，但试剂较贵，不易购买。在研究神经退行性疾病中，髓鞘染色通常与尼氏染色相结合，使结果对比鲜明。Chen等［18］探讨3，4二羟苯基乳酸(DLA)对脊髓压迫损伤后的炎症影响。Luxol固蓝和Nissl染色结果显示，经DLA施用后的大鼠，伤后d 10髓鞘退变缓慢。朱桂彬等利用改良的Marsland银染法与Luxol固蓝双重染色观察人老年痴呆症尸检脑组织。结果发现脑组织中老年斑呈均质的嗜银团，神经元纤维增粗，扭曲形成缠结清晰可见，且染色背景清晰，几无银颗粒沉淀。

5 突触染色(synapse staining)

目前有两种显示神经突触的方法。镀银染色法通常采用Cajal染色法和Golgi染色法来显示突触，其主要根据突触的嗜银性而使突触着色［19］。但由于过程繁琐，染色结果不稳定而未被广泛使用。Singh［20］通过改良镀银染色发现，大鼠伤后d 7即可在神经纤维网齿状回观察到少量退变突触。杨壮来将Cajal法进行改良并成功显示神经突触。改良后的方法具有神经突触及包体内神经元纤维染色清晰，方法简单，稳定，切片可长久保存而不退色的特点。磷钨酸染色法是利用重金属浸染神经突触，然后通过电镜观察突触结构及数量变化。缺点是组织固定时需采用锇酸，毒性较强，且价格昂贵。Shankar等［21］通过磷钨酸染色证实，突触结构及机能的可塑性变化与学习，记忆功能有着密切联系。韩玉泽等借助磷钨酸染色电镜观察患有克汀病的大鼠小脑突触分布，发现颗粒层中突触数目较少，且形成不全。

6 神经纤维染色(nerve fiber staining)

神经纤维染色也是依据神经纤维对银离子的特殊吸附性，但方法不同。1904年Bielschowsky等通过甲醛溶液将吸附于神经纤维内的银复合物还原生成棕黑色铬银沉淀，但难以浸染溃变的神经纤维。Fink等［22］将组织切片依次浸入高锰酸钾、草酸和苯二酚混合液、硝酸铀进行预处理，选择性浸染出溃变的神经纤维。但由于银颗粒易在正常组织中沉积，造成切片背景不清晰、溃变纤维及其终末不易辨别的缺陷。随后，De Olmos［23］将组织切片先经铜银溶液处理，抑制正常神经纤维浸染。该法具有染色背景清晰，溃变纤维结构明显可见的特点。毕彦忠等将氨银溶液的配置方式进行简化，使神经纤维浸染及背景更为清晰，同时操作简单，节省试剂成本。此外，何金鑫等报道固定液的选择对神经纤维染色有一定的影响，其中丙酮固定后染色效果最好。Gallyas［24］将溃变神经纤维染色法应用于阿尔采末病等神经退行性疾病的病理诊断研究。与Bodian染色法相比，该法可抑制正常神经组织浸染，仅对神经元纤维缠结、胶质细胞变性，包涵体等异常结构选择性染色。

神经退行性疾病除了引发神经组织自身受损外，亦会引起一些神经毒性物质和蛋白的异常表达。如Tau蛋白、GFAP和CR3分别为少突胶质细胞、星形胶质细胞及小胶质细胞受损的特异性标识物［25］。髓鞘碱性蛋白(MBP)是由少突胶质细胞分泌。当MBP大量丢失会引起髓鞘受损，进而引起轴突受损。因此，除了神经组织染色技术外，免疫组织化学，免疫沉淀反应等技术同样在显示其病变结构研究中扮演着重要角色。它是利用抗原抗体反应与形态学结合，对组织中的抗原做定性、定量、定位检测，具有操作简单，灵敏度高的特点。缺点是抗原活性容易丢失，或者存在非特异性染色而影响结果判定。总而言之，一种准确、可靠的神经组织染色方法，需要具备被染对象特异性高、操作简便、试剂价格低廉、无毒、灵敏度高及稳定性好等特点。

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