分子生物学技术在肠致泻性大肠杆菌诊断中的应用*

陈爱平,陈建辉,杨劲松,林 杰

2.福建医科大学公共卫生学院教学基地 ,福州 350001

在全国食物中毒事件分析中,微生物类引起的食物中毒事件一直占据着食物中毒原因分类的首位,其中又以细菌性的病原体如副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌和沙门菌等为主[1-2]。2010年我们检测了两起群体食源性食物中毒腹泻病原体以及一起疫苗接种偶合病例的粪便标本,发现可疑病原菌均为肠致泻性大肠杆菌引起;如果只根据传统的血清、生化的实验结果,没有进一步结合分子生物学技术,这些病原菌就可能被鉴定为普通的大肠杆菌。经文献检索发现,目前国内大部份实验室在肠致泻性大肠杆菌诊断方面还是以传统的细菌常规培养、生化、血清鉴定为“金标准”。肠致泻性大肠杆菌包括肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠粘附性大肠杆菌(EAEC)五种病原菌。常规的生化鉴定一般只能鉴定到大肠埃希氏菌,而且肠杆菌本身生化表现就相对比较活泼,很难运用生化来区分五种病原菌;血清学诊断在致泻性大肠杆菌中是起辅助诊断作用,且国产的致泻性大肠杆菌血清存在血清因子不全,血清交叉凝集等问题,对诊断起了干扰作用。将分子生物学和传统培养及生化血清两类鉴定方法有机地统一结合,是提高由致泻性大肠杆菌引起的食物中毒病原菌检验准确率的一个有力的手段。常用的五大致泻性大肠杆菌常规 PCR检测特异的诊断基因分别有[3-5]：ETEC(ST-耐热肠毒素、LT-不耐热肠毒素),EPEC(eaeA-粘附抺平因子、bf p-束状菌毛因子),EIEC(virA-质粒毒力基因、ipaH-侵袭性质粒抗原),EHEC(eaeA-粘附抺平因子、stx-志贺样毒素),EAEC(aggR-粘附聚集因子)。

下面我们对2010年两起食物中毒事件和一起疫苗接种偶合病例病原菌检测的案例进行分析,说明分子生物学技术在致泻性大肠杆菌诊断中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本的常规分离培养 按WS271-2007《感染性腹泻诊断标准》进行培养分离。

1.2 生化鉴定 采用法国生物梅里埃公司生产的API 20E生化鉴定条以及广东环凯微生物科技技术有限公司生产的生化微量管。

1.3 血清学诊断 采用玻片凝集,诊断血清的生产厂家为宁波天润,在有效期内使用。

1.4 实时荧光PCR(RT-PCR) 实时荧光诊断试剂盒厂家为上海之江生物科技有限公司,模板DNA的提取及实时荧光PCR的反应体系及扩增程序按照试剂盒使用说明书。

1.5 引物 引物序列依据相应文献描述[4-7],寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.6 常规PCR反应条件 PCR反应均采用20 μ L的反应体系,除了特殊说明,各组成成分的终浓度分别为：Ex T aq DNA聚合酶 0.5 U,dNTP 200 μ mol/L,上 游 引 物 0.4 μ mol/L,下 游 引 物 0.4 μ mol/L,DNA 模板 2 μ L 。

1.7 模板的制备 1)直接吸取细菌增菌液1.5mL,13 000r/min离心2min,弃去上清,沉淀下来的细菌加入100μ L的纯水制备成菌悬液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min离心5min,取上清作为实时荧光PCR检测的DNA模板。2)分纯的细菌菌落,直接刮取适量于300μ L的纯水制备成菌悬液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min离心5min,取上清做为实时荧光PCR及常规PCR检测的DNA模板。

1.8 试剂仪器 Ex Taq DNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司,琼脂糖为BioAsia分装品,电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-6C型,读胶仪为上海培清生产的JS-380,PCR扩增仪为GStorm(英国GeneTech公司),实时荧光PCR仪为澳大利亚的Corbett公司生产的Rotor-gene 6000。

1.9 DNA序列的测定及比较 序列测定由上海生工完成,PCR扩增产物进行双向测序后用DNAS-tar分析软件进行拼接,校正后的序列在NCBI网站上进行核苷酸的Blast比较。

2 结 果

2.1 案例一

2.1.1 事件概况 2010年11月9日,福州某地幼稚园发生一起疑似食物中毒事件,总共25名学生出现腹痛、腹泻、发烧、呕吐等症状,年龄在5-6岁之间。11月16日基层CDC将从两名患儿粪便分离的细菌培养皿送到我们实验室,其中一名患儿送检沙门菌显色平板和大肠杆菌显色平板各1个,另一名患儿送检沙门菌显色平板1个。其中从一名患儿的大肠杆菌显色平板上检出侵袭性的大肠埃希氏菌(EIEC)。

2.1.2 分子生物学、生化及血清检测结果如下 实时荧光PCR检测显示侵袭性的大肠埃希氏菌(EIEC)特异的核酸片段阳性。常规PCR检测结果为EIEC特异的诊断基因(ipaH,virA)阳性。生化实验表现为API20E生化鉴定条和手工微量生化管鉴定符合大肠埃希氏菌特征。(主要生化表现：葡萄糖⊕、乳糖 +、麦芽糖+、甘露醇 +、蔗糖-、靛基质+、甲基红+、VP-、枸椽酸盐-、尿素-、苯丙氨酸-、丙二酸盐钠-、水杨素-、氧化酶-、硝酸盐还原+、鸟氨酸脱羧酶-、精氨酸双水解酶-、赖氨酸脱羧酶+、硫化氢-、葡萄糖铵+)。现有的 EIEC诊断血清不能分型。

2.1.3 结合生化及分子生物学的检测结果判定为EIEC基因阳性的大肠埃希氏菌。

2.2 案例二

2.2.1 事件概况 2010年11月9日漳州某地幼儿园发生一起疑似食物中毒事件。症状主要表现为呕吐、腹泻,腹泻次数最高的达10～20次/天;伴有或不伴有发热、畏寒、头痛、头晕、腹痛、肢体抽搐、全身脱水等症状。至11月10日凌晨,类似症状的患儿逐渐增多,共发现疑似食物中毒病例共50例,其中临床诊断病例29例。2010年11月15日基层CDC将从三份患儿粪便分离的细菌培养皿送到我们实验室：患儿1血平皿1个、沙显培养平皿1个,患儿2麦康凯平皿 1个、患儿3血平皿1个、山梨醇麦康凯平皿1个。其中我们从患儿3血平皿的菌落中检出致病性的大肠埃希氏菌(EPEC)。

2.2.2 分子生物学、生化及血清检测结果如下 实时荧光PCR检测显示致病性的大肠埃希氏菌(EPEC)特异的核酸片段阳性。常规 PCR检测EPEC特异的诊断基因(eaeA,bf p)阳性。生化实验结果表现为API20E生化鉴定条和手工微量生化管鉴定符合大肠埃希氏菌特征(主要生化表现同案例二)。现有的EPEC诊断血清不能未分型。

2.2.3 结合生化及分子生物学的检测结果判定为致病性的大肠埃希氏菌(EPEC)。

2.2.4 2010年11月22日基层CDC第二次送检部分标本,为这起事件中的8份腹泻患儿的肛拭子的乳糖胆盐增菌液。肛拭的采样时间为2010年11月10日,当日增菌后放置于4℃冰箱,2010年11月15日对第一次增菌的增菌液进行二次增菌后放置于4℃冰箱。二次送检标本的实验结果如下：实时荧光的检测显示8份二次增菌液的DNA提取物中有6份EPEC核酸片段阳性。对二次增菌液的常规分离培养没有分离到EPEC大肠埃希氏菌。

2.3 案例三

2.3.1 事件概况 2010年10月,我省某地发生一例乙脑疫苗接种偶合死亡病例。该病例为八月大的婴儿,接种乙脑疫苗4d后死亡。死亡前1～2d无排便、进食差、腹胀明显、叩诊腹部鼓音。临终前4～5h呻吟、肚子胀明显,死亡前 1h腹泻 1次,呈蛋花样,无呕吐。从该病例的粪便标本中分离到非典型肠致病性大肠杆菌(aEPEC)。

2.3.2 分子生物学、生化及血清检测结果如下 实时荧光PCR检测从该病例肛拭标本直接提取的DNA结果为EPEC-A基因阳性,而EPEC-B基因阴性。常规PCR检测从粪便标本中分离纯化可疑菌落的aEPEC诊断基因,结果为eaeA阳性、bf p阴性。实时荧光PCR检测从粪便标本中分离纯化可疑病原菌的stx1和stx2基因,结果均为阴性。常规PCR扩增的eaeA基因,进行序列测定后在NCBI上Blast的结果均提示为大肠杆菌O157∶H7、EPEC紧密素(intimin)的eaeA基因。生化实验结果表现为API20E生化鉴定条和手工微量生化管鉴定符合大肠埃希氏菌特征(主要生化表现同案例二)。现有的EPEC诊断血清不能分型。

2.3.3 综合分子生物学、序列分析及生化和血清的检测结果判定为不典型的肠致病性大肠杆菌(aEPEC)。

3 讨 论

案例一的事件中,基层CDC采集9名患者肛拭子标本,根据生化特征及致泻性大肠杆菌血清不凝集的情况,结果只能判定检出大肠埃希氏菌。目前国产的致泻性大肠杆菌诊断血清存在着一些问题,包括血清因子不全,血清交叉凝集,血清效价及血清质控等问题,对诊断起了干扰作用;同时由于肠杆菌本身血清、生化表现比较活泼,存在有新的血清型和特殊的生化反应的可能性,根据常规的检测方法有可能造成致泻性大肠杆菌的漏检。由于此次事件中,基层只送检了两名患儿粪便分离的细菌培养皿,我们只从1名患儿中检出 EIEC,无法明确是否由EIEC引起的这起食物中毒。

案例二的疑似食物中毒事件,临床诊断病例有29例,起先我们收到三个患儿的粪便分离培养物,从一例患儿中分离到EPEC病原菌,对于是否是由于该病原菌引起的食物中毒缺少说服力。实时荧光PCR从第二次送检的8份增菌液的DNA提取物中,检出6份EPEC核酸片段阳性,虽然对二次增菌液的常规分离培养我们没有得到活的EPEC病原菌,但是8份二次增菌液的DNA提取物中有6份显示EPEC核酸片段阳性,同时结合11月15日送检的三份患儿粪便分离的细菌培养皿中检出一份EPEC病原菌阳性,基本上可以断定这起可疑的食物中毒事件的病原菌是EPEC。考虑二次增菌液已经存放的时间(8d左右)和存放温度,可能大部份病原菌已经死亡,残余的活病原菌数量在常规分离培养的检测限下,造成分离培养的结果为阴性。分子诊断方法在敏感性方面要优于常规的分离培养,特别是实时荧光技术由于多了一条特异的探针,比常规的PCR特异性又相对地提高,是目前各种病原菌应急检测的首选方案。

案例三从肛拭标本直接提取的DNA进行实时荧光基因检测,结果为EPEC-A基因阳性、EPEC-B基因为阴性;根据试剂盒提供的判断标准,提示为不典型的肠致病性大肠杆菌(aEPEC)核酸检测阳性。我们运用常规PCR扩增分纯细菌的eaeA和bf p基因,结果也吻合aEPEC的病原菌特征,即eaeA基因阳性、bf p基因阴性。eaeA序列测定后在NCBI上进行Blast,结果提示该序列是O157∶H7、EPEC的紧密素(intimin)的eaeA基因。同时该病原菌生化鉴定的结果符合大肠埃希氏菌特征,现有典型的EPEC血清群都不能凝聚,综合以上结果,鉴定该病原菌为aEPEC(未分型)。这与国际上报道的目前大部分的aEPEC血清不能归于现有典型的EPEC血清型的结果也吻合[8]。在遗传关系上,aEPEC和肠出血性大肠杆菌(EHEC或STEC)更为密切,但是不含有类志贺毒素stx1和stx2。我们运用实时荧光PCR检测该stx1和stx2基因的结果也均为阴性。

在这三个案例中,若只依据生化和血清的检测结果,病原菌都只能鉴定为普通的大肠埃希氏菌,造成错误的判定。根据属地管理原则,食物中毒的病原检验任务主要由基层疾控中心承担,而大多数基层疾控中心没有条件和技术来开展分子诊断,如常规PCR、实时荧光PCR(RT-PCR)等,仍然主要采用传统的培养鉴定来完成。基层通常是在初步生化反应符合大肠杆菌特征后,进行血清凝集试验,根据血清凝集的结果来判定相应的病原群,如果血清不凝集就只能当做肠道的正常菌群大肠埃希氏菌来报告,可能导致肠致泻性大肠杆菌检测出现假阴性或者假阳性的情况。

将分子生物学技术和传统的分离鉴定两类方法有机地统一结合,是目前提高致泻性大肠杆菌检验准确率的一个有力的手段。目前较普及的分子生物学诊断技术有实时荧光PCR和常规PCR,由于实时荧光PCR敏感性和特异性均较优于常规PCR,且操作简单耗时短。根据检测标本种类的不同,本方法既可以做为病原菌初筛的手段指导常规分离培养的方向(主要针对增菌液的DNA提取物),也可以对分纯的细菌培养物进行鉴定诊断。常规PCR由于扩增的基因和片段大小比较明确,还可以进行后续的测序分析,通常可以对可疑分纯细菌的进一步确认实验。同时,分子诊断技术由于针对的是病原菌核酸片段,即使细菌已经死亡,只要核酸没有被完全降解,同样能够进行检测;同时由于 RT-PCR的敏感性通常比常规的分离培养要高,当病原菌的数量在常规分离培养的检出限以下,运用分子诊断方法仍然可以检测出核酸片段。因此对细菌性病原菌来讲将分子生物学诊断手段与常规分离鉴定方法的有机结合,是今后公共卫生事件实验室调查的一个有力手段。

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[2]苏建忠,国文,汤芳.2007-2008年全国食物中毒发生情况分析[J].武警医学院学报,2010,19(7)：568-570.

[3]卫生部.中华人民共和国卫生行业标准(WS271-2007)《感染性腹泻诊断标准》[S].

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[5]Vidal R,Vidal M,Lagos R,et al.Multiplex PCR for Diagnosis of Enteric Infections Associated with DiarrheagenicEscherichia coli[J].J Clin Microbiol,2004,42：1787-1789.

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[7]蔡军,王金良.多重PCR和基因芯片检验致病性大肠埃希菌[J].现代检验医学杂志,2005,20：87-88.

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