布鲁氏菌检测技术的研究进展

许邹亮 ，南文龙 ，陈义平

（1.中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛 266032；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）侵入机体引起的人兽共患传染病，我国将其列为二类传染病[1]。布鲁氏菌可感染包括人类在内的多种家畜和野生动物，主要通过消化道、皮肤黏膜、呼吸道等途径侵入机体，感染后引起相似的临床症状，如长期发热、流产与不育、虚弱、关节痛及肝脾肿大等。

目前，布鲁氏菌属已有10余个种的布鲁氏菌存在[2]，不同种的布鲁氏菌具有明显的宿主危害倾向性，但大多具有不同宿主间的交叉感染能力，可引起严重的公共卫生问题。布鲁氏菌病在我国广泛存在，尤其在以畜牧业生产为主的地区。截至2009年，全国有29个省（区、市）发生畜间布鲁氏菌病，牛、羊、猪感染达百万头之多，人的布鲁氏菌病亦呈上升趋势，2009年全年新增人布鲁氏菌病3.7万例[3]。世界范围内，每年出现约50万例人布鲁氏菌病[4]。

目前尚缺乏成熟的人用疫苗。人感染该病主要途径为接触感染动物。因此，加强对牛羊等易感动物的检疫，淘汰感染病畜，消灭传染源是防控布鲁氏菌病切实可行的途径。为防控该病，各国学者建立了多种布鲁氏菌病诊断和检测技术，主要包括细菌学、免疫学和分子生物学方法等，本文即对相关检测技术研究进展做一简要综述。

1 细菌学检测方法

病原分离鉴定是诊断布鲁氏菌病的传统方法，被认为是诊断该病的“金标准”。但布鲁氏菌生长缓慢，所需营养复杂，而且必须保证一定量的活菌才能得到分离，同时，分离过程中存在生物安全问题，必须在P2级以上实验室进行操作，具有潜在的危险性，所以在布鲁氏菌病诊断及防制中难以推广。

2 免疫学方法

2.1 传统免疫学方法

传统免疫学方法主要包括虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、乳环试验（MRT）、2-巯基乙醇试管凝集试验（2-ME）和补体结合试验（CFT）等几种方法。RBT和SAT操作简便，目前在国内较为常用，适用于布鲁氏菌病的基层检测应用；在国际贸易中，RBT也是牛、羊、猪布鲁氏菌病的指定检测方法。MRT是检测牛、羊等动物奶样的主要检测方法[5]。CFT比RBT、SAT特异性强，也有标准化体系，但操作较为复杂。由于这些常规免疫学方法是基于抗体对抗原表面脂多糖O链的检测，容易与如耶尔森氏菌O:9等细菌产生交叉反应。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

运用ELISA检测布鲁氏菌抗体的研究报道较多，目前已有相关的商品化试剂盒，主要包括人布鲁氏菌IgG抗体ELISA试剂盒、猪布鲁氏菌抗体ELISA检测试盒和犬布鲁氏菌IgG抗体ELISA试剂盒等。Weynants等[6]以辣根过氧化物酶标记的单抗12G12和羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1的光滑型LPS建立了c-ELISA，并对936份血清样本检测，结果证明其特异性高于CFT和RBT。2004年，c-ELISA方法以其高特异性和敏感性的优点被OIE列为诊断和清除牛布鲁氏菌病的推荐方法。2006年，Gall等[7]建立了一种适用于现场诊断的FldELISA方法，该方法能在15分钟内检测布鲁氏菌抗体，敏感性和特异性分别为100%和94.2%。2009年，Chaudhuri等[8]用omp28重组外膜蛋白抗原建立的iELISA方法，对382份牛血清进行检测并与RBT试验比对，结果敏感性为88.7%，特异性为93.8%。

2.3 荧光偏振试验（FPA）

FPA是利用抗原/抗体相互作用的一种快速检测技术，操作简单，但需要专门的仪器设备。诊断布鲁氏菌病时，可将牛种布鲁氏菌光滑型LPS的小分子量片段OPS标记上FITC作为抗原，用此抗原加到稀释的血清或全血中，抗体含量可在2分钟（血清）或15分钟（全血）内用荧光偏振试验分析测定出来。FPA诊断牛种布鲁氏菌的特异性和敏感性几乎与c-ELISA相同。Lucero等[9]用FPA方法对84份怀疑感染布鲁氏菌的病人血清检测，其中15例FPA和c-ELISA都能检出，3例只有c-ELISA检出，4例只有FPA检出。Gall等[10]用FPA检测牛种布鲁氏菌，并与其它血清学检测方法进行比较，认为FPA是检测牛布鲁氏菌最稳定的血清学方法之一，其敏感度和特异性分别是96.3%和97.6%；通过双盲实验证实荧光偏振法还可以区别牛种布鲁氏菌感染和疫苗株S19免疫接种。Schumaker等[11]用FPA方法对自然环境中野牛的布鲁氏菌病感染情况进行血清学调查，FPA显示出很高的敏感性。

2.4 免疫胶体金层析法（GICA）

Henk等[12]在2003年建立了两种免疫胶体金层析法，一种用于检测布鲁氏菌特异性的IgM，另一种用于检测IgG。这两种方法能够检测急性、持续性和反复发作性感染，可用于指导病人的治疗。

3 分子生物学方法

3.1 PCR及Real-time PCR

1992年，Herman等[13]将牛种布鲁氏菌和根瘤土壤杆菌序列比对后，选择保守性较强的16 S rRNA作为扩增片段，能够特异、敏感、快速地检测布鲁氏菌。Leal-Klevezas等[14]利用PCR技术诊断山羊布鲁氏菌病，并与常规的血清学和细菌学方法进行比较，在对300份临床样品的检测中，针对血液样本，PCR方法的阳性检出率为86%，而血清学方法的阳性检出率为60%，只从一份血培养中分离到细菌；针对奶样，PCR方法阳性检出率为64%，但是培养时却没有分离到细菌。Gupta等[15]利用omp31基因设计引物建立PCR方法，用于山羊布鲁氏菌病的检测，在对54份有流产史的山羊奶样检测中，血清学方法阳性检出率为59%，而PCR为88.8%，对照试验中PCR的灵敏性和特异性分别为90%和100%。2005年，Elfaki等[16]建立了基于31KD布鲁氏菌抗原基因序列的PCR检测方法，结果能从待检血清中扩增出223 bp大小的目的片段，阳性检出率达96%，试验证明血清是一种适用于PCR诊断布鲁氏菌病的样本。

2005年，Debeaumont等[17]建立了用于检测人血清样本中布鲁氏菌的Real-time PCR方法，特异性和敏感性均优于细菌分离和血清学方法。2009年，Vladimira等[18]基于IS711基因建立了Real-time PCR方法用于检测野猪血液样本中的布鲁氏菌，并与细菌分离和血清学方法进行比较，结果显示IS711 real-time PCR方法从血清阴性的样本中检出11.1%（16/144）的阳性。2010年，孟茹等[19]利用二重Real-time PCR技术建立了鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法，对24份结核痰样、11份布鲁氏菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测，符合率为100%。

3.2 核酸探针检测

核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。1996年，Matar等[20]用PCR从BCSP31基因序列上扩增出223bp的目的片段，然后用25 bp地高辛标记的探针对该序列进行杂交，结果显示出良好的特异性。同年，王希良等[21]用牛种布鲁氏菌构建PBC4重组质粒，经Kpnl和BamHI双酶切回收224 bp的DNA片段，将此片段纯化后采用地高辛标记方法制备探针。点杂交结果表明，此探针检测布鲁氏菌DNA的灵敏度达5 pg，对中国19个布鲁氏菌分离株DNA杂交出现强的杂交信号而对其它5种革兰氏阴性菌DNA以及人白细胞DNA没有产生杂交反应。2000年，Fernandez-Lago等[22]以牛种布鲁氏菌16 S rRNA序列制备荧光寡核苷酸探针进行全菌杂交试验，利用B6、B9和B13三种荧光探针鉴定出了所有种型的代表菌株以及9株不同的临床分离株，其中B9探针可以将猪种布鲁氏菌2、3、4、5型与其它种型布鲁氏菌鉴别。

3.3 PCR-ELISA技术

PCR-ELISA技术结合了PCR的敏感性、探针的特异性等优点，具有级联放大的效果。2003年，Morata等[23]建立了一种检测布鲁氏菌病的PCR-ELISA方法，结果能从3.5μg人基因组DNA的背景中检测到10 fg的细菌DNA，相当于2个细菌。通过对布鲁氏菌病患者的59份外周血液样本及113份对照样本进行检测，敏感性和特异性分别为94.9%和96.5%，而血液培养的敏感性只达到70.1%。2004年，Alahouk等[24]建立了一种新型PCR-ELISA体系，可用于临床样品的高通量检测。

综上所述，各种检测技术各有所长，细菌分离仍是布鲁氏菌病诊断的金标准，在我国，大规模的布鲁氏菌病普查仍以传统的血清学方法为主，而以ELISA为代表的免疫学方法和以PCR技术为基础的分子生物学方法以其敏感性高和特异强的特点将具有良好的应用前景。

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