核酸提取方法的研究进展

张 丽 ，杨莲茹 ，吴绍强

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100029）

核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测，物种鉴定，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等常用研究手段之一[1]。然而，能否提取出高质量的核酸分子则是核酸分子生物学试验中关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。

1869年，瑞士医师Friedrich Miescher首例成功的进行了核酸提取[2]。起初，他关注于组成白细胞各种蛋白质，并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现，当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物，再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功从细胞中提取出DNA后，一些研究者纷纷效仿，并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索，由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。现如今，从硫氰酸胍盐-苯酚-氯仿提取法到柱纯化技术，已被广泛地用于DNA和RNA的提取。

核酸提取的关键在于组织细胞的裂解和核酸纯化两大步骤，本文据此对核酸提取的研究进展进行分析和讨论。

1 组织细胞裂解方法

组织细胞裂解提取核酸的方法主要包括胍盐裂解法、碱裂解法、CTAB裂解法以及酚抽提法等。

1.1 胍盐裂解法

胍盐是蛋白强变性剂，核酸提取一般采用高浓度的胍盐来裂解细胞，促使核蛋白体解离，同时高浓度的胍盐能使细胞内核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich 等[3]首次使用异硫氰酸胍从总RNA中分离纯化出mRNA。该方法特点是利用多数真核细胞中 mRNA 的3'端有 polyA 尾巴，使用oligo（dT）—纤维素亲和层析法，从总RNA中分离纯化出mRNA，但此方法费时费力。在 Ulrich 研究的基础上，1979年 Chirgwin 等[4]发明了一种破裂细胞膜但不破坏核苷酸的方法，即先将组织在异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中混合均匀，然后通过乙醇抽提或氯化铯梯度超速离心来分离纯化细胞中的RNA。该技术是首次能特异性分离RNA 的方法，但还是存在诸多缺点，比如耗时长、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有机溶剂，操作有一定的风险性。到目前为止，虽然在此基础上发展出了很多核酸提取技术，但均没有克服耗时长、危险性大等诸多弊端。

伴随着生物产业的商业化发展，很多试剂公司依此设计研制出了很多商品化试剂，如 TaKaRa 公司的DNAiso Reagent，该试剂中含高浓度的胍盐，可从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞中简单、快速的提取基因组DNA，且获得的基因组DNA纯度高、完整性好。整个操作过程也不使用苯酚等毒性有机溶剂，实验危险性小。

1.2 碱裂解法

碱裂解法是从E.coli中分离制备质粒DNA常用的方法之一，已有30多年的发展历史。1979年，Birnboim和Doly成功用碱性裂解液快速提取筛选重组质粒DNA[5]。该方法基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离质粒DNA目的。细菌悬浮液在pH12.6的碱性溶液十二烷基硫酸钠（SDS）中，会使细胞壁破裂，蛋白质和染色体DNA变性，质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链在拓扑学上是相互缠绕的，彼此不会分离。当pH恢复到中性时，变性的质粒DNA分子迅速复性，呈溶解状态，而蛋白质与染色体DNA不能复性而呈絮状沉淀。通过离心处理可除去染色体DNA与不稳定的大分子RNA以及蛋白质-SDS复合物等，而质粒DNA保存在溶液中。而且，在SDS存在的条件下，碱裂解法对E.coli的所有菌株都适用。

目前市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在此方法基础上并结合柱离心法发展而来。离心柱采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA。试剂盒提取质粒DNA的优点是：DNA纯度高。

1.3 CTAB裂解法

1980年，Murray和Thompson 发明了一种方法[6]：使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。经液氮研磨样品后，用适当体积的 CTAB 缓冲液重溶样品。CTAB是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来[7]。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB 裂解法对产生大量多糖的生物体的核酸提纯非常有用的，如植物和某些革兰氏阴性菌，但这种方法的缺点是：实验步骤多，操作较繁琐。

经过方法改进，可以将CTAB与其它方法相结合以快速提取高纯度的动植物DNA。彭敏等[8]用贝类闭壳肌为样品，参照Nie C等[9]的SDS-CTAB结合法，利用高浓度盐离子和SDS除去蛋白和多糖，然后用低浓度盐离子和CTAB进一步纯化DNA。改进后的SDS-CTAB法提取的DNA，具有纯度高，无蛋白质和RNA污染的优点。

1.4 酚抽提法

苯酚作为蛋白变性剂，能使蛋白质快速变性，因此，可用来提取基因组DNA：先用 EDTA 和 SDS 为主的裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶 K 处理后，然后用pH8.0 的 Tris 饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的核酸DNA。酚抽提的基本原理是：苯酚处理匀浆液时，由于蛋白质与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团，与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于有机相酚中，而DNA溶于水相。离心分层后取出水相，再利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀出核酸DNA。最早的分离方法是由 Blin 等[10]根据Gross-Bellard 等提出的原始方案改良并建立的酚抽提法。此法的优点是提取的DNA保持天然状态，且纯度高，可满足临床各种检测所需；缺点是操作繁琐，比较费时，而且使用毒性有机溶剂苯酚对试验人员有一定的危害。

因苯酚不能完全抑制RNase活性[11]，研究者在酚抽提法的基础上又进行了发展改进，改用酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合液提取纯化核酸。加入混合液离心分离后，溶液分为两相，油相在下，水相在上。蛋白质，脂质，糖类和细胞碎片等杂质在油相，DNA在水相中，分离出水相，加入乙醇沉淀DNA，离心获得核酸DNA[12]。该方法获得的核酸DNA具有更高的纯度，但还是难免繁琐的操作。

2 核酸的纯化过程

若组织细胞中含较多的多糖或其它次生代谢产物，如酚，酯，萜等，提取高纯度DNA 就相对比较困难，进而影响后续的各种试验分析，因此，需要对提取的核酸进行进一步纯化处理[13]。现在市场上有许多商品化的核酸固相提取纯化试剂盒，与常规方法相比它能快速有效的提纯核酸[14]。

此方法常用的固相基质有二氧化硅基质，磁珠和阴离子交换介质，四个关键步骤是：细胞裂解，核酸吸附，洗涤和洗脱[15]。首先加入裂解液裂解细胞；其次用特别的 pH 缓冲液调节柱子pH改变其表面或官能团，使其成为特殊的化学形式以吸附核酸[16]；再次，用洗涤缓冲液洗涤以除去蛋白质等杂质；最后，用 TE缓冲液或水洗脱柱子上的目的核酸，收集纯化的核酸。通常情况下，提取过程的洗涤和洗脱步骤都需要用到快速离心，真空过滤等步骤，对仪器设备有一定的要求。

2.1 二氧化硅基质法

二氧化硅基质类型包括玻璃微粒，二氧化硅粒子，玻璃微纤维和硅藻土[17]。二氧化硅基质提取的基本原理[18-19]：带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子Na+发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。

2.2 磁珠法

磁性分离是一种简单有效的核酸提纯方法。通常，核酸提纯可使用的磁性载体有：有亲和力的固定配体或对目的核酸有亲和力的磁性载体。例如，不同的合成聚合物、生物聚合物和磁粉等。

磁珠表面连接了可特异地与DNA发生作用的功能基团，具有可逆吸附DNA的特性，通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。若裂解液提供适宜的离子强度、pH等条件，功能团的数量就决定了磁珠吸附DNA的量，因此，需要将裂解液设置不同的稀释度，摸索最佳离子强度、pH等条件。同时，需要制备不同浓度的DNA样本，使最高DNA含量在磁珠吸附能力的限度范围内。磁珠法提纯核酸最大的优点就是自动化，以及提供的试剂可用于磁性工具，现在市场上可买到许多以磁珠为基础的核酸提纯试剂盒。而且这种试剂盒不需要任何有机溶剂，也不需要反复离心，真空过滤或柱分离等步骤，仅仅是以核酸结合磁粉为基础，大大减少了试验对工作人员的危害，以及降低了对试验设备的特殊要求。

2.3 阴离子交换法

阴离子交换树脂以树脂表面带正电荷的二乙基胺基乙基纤维素（DEAE）群和DNA骨架上带负电荷的磷酸盐相互作用为基础。树脂表面面积大能稠密的耦合 DEAE 群。在低盐的碱性溶液存在的条件下，DNA可与DEAE群结合，洗涤除去树脂上的蛋白质和RNA杂质，最后用高盐的酸性溶液洗脱仍结合在树脂上的核酸DNA。此方法能有效的从RNA和其它杂质中分离DNA分子。其中，盐浓度和 pH 是核酸能否很好的与柱结合或洗脱的关键因素。

3 核酸的一步法提取

通常，生物大分子的提取或纯化技术只能从生物体中单独提取一种类型的核酸（DNA或RNA）或蛋白质。如需从有限的细胞或组织材料中同时提取DNA、RNA和蛋白质，则需要分别提取，显然提取效率不高。因此，一步法应用而生[20]。

1987年，Chomczynski 和 Sacchi 改进单步提取法，将异硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）结合起来，并在 1989 年成功注册商标为 TRIzol®。该方法以异硫氰酸胍在低 pH 的苯酚单相溶液中裂解细胞为基础[21]。混合液中加入氯仿后离心形成三相溶液，DNA和蛋白质在有机相和中间相，RNA在水相，通过乙醇或异丙醇沉淀有机相可分离DNA和蛋白质，加入异丙醇从水相中沉淀RNA[22]。该方法将核酸提纯步骤缩短到了一步，有诸多优点，如缩短分离时间，增加样品通量，扩大了样品选择范围，允许研究人员从更少量样品中纯化RNA。尽管优化了纯化步骤，但这种方法仍然有一些局限，比如，超速离心对设备的特殊要求，超速离心后也经常导致RNA凝集，形成球块，不利于悬浮，且粗糙的有机溶剂会引起样品中RNA断裂等等。

一体化提取还有很多商品化的试剂盒。诸如以吸附柱为基础的提取试剂盒，可以从同一生物样品中同时提纯基因组DNA、总RNA和总蛋白质，且用乙醇沉淀，不使用苯酚或氯仿等毒性有机溶剂。此类试剂盒适合于从少量的各种细胞培养物、动物及人类自身的组织中同时提取DNA、RNA和蛋白质。商品化的自动化提取系统是为处理大批量试验样品而设计的，该系统借助自动化仪器简化核酸提取步骤，可节省工作时间，降低人工成本，提高操作者自身安全，而且能增加结果的再现性[23]。

4 展望

对动植物样品的分子生物学分析，就必须送达实验室进行，非常不便。诸如血液等临床样品，需要冷藏运输到实验室，不能满足就地、快速确诊的需求。目前，环介导等温扩增（LAMP）、核酸层析试纸条等现场核酸检测技术应运而生，并得到广大科研及检测人员的青睐，但是便携、现场化的核酸提取技术相对匮乏。同时，考虑到商品化核酸自动化提取仪是在一个相对狭小的空间内进行多个样品的同步操作，存在样品间交叉污染的风险。因此，在压缩体积实现仪器便携化的同时，优化样品处理流程，增加防止核酸相互污染的装置，也是研究者将来需要重点考虑的问题。

总之，自动化技术的迅速发展带动了核酸自动化提取系统的发展。但目前自动化提取系统存在的诸多问题也是显而易见的。为了满足科研及实际检测工作需要，将来的预期是发明一种一体化的生物分子提取系统或一个微型便携的提取系统。

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