猪传染性疾病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较及适用性评估

史喜菊，马贵平，刘全国，李炎鑫，李冰玲

（北京出入境检验检疫局，北京 100026）

1 前言

国际动物卫生组织（OIE）制定的动物卫生标准是WTO中SPS协定唯一认可的动物卫生规则，作为技术法规和仲裁国际贸易纠纷的技术依据，得到了世界各国兽医工作者的一致认可。OIE的诊断标准体系完善、内容科学，有分布于全球的OIE参考实验室作为技术后盾，这些诊断技术代表了全世界兽医工作的最高水平，科学性、实用性和先进性都很强，是世界各国在兽医技术能力建设上所参照的国际标准。随着全球经济一体化进程的加快，动物和动物产品的国际贸易也进入了国际竞争时代，各国对动物的健康状况和卫生水平以及动物产品的安全性提出了更加苛刻的要求，一些国家借此设置各种贸易技术壁垒，限制别国的产品出口，以此实现贸易保护。近年来我国动物检疫标准的制修订工作取得了一定的成绩，但还没有建立起与国际接轨的动物卫生标准体系，用国际标准衡量时，我们所制定的标准的技术水平和内容的涵盖范围还有诸多不足，动物卫生标准化工作还远不能适应入世后的贸易和社会发展需要。为了应对国际贸易的需要，促进国家标准、国家法规的协调性特别是与国际标准的接轨，现以OIE规定的猪传染性疾病（11种）为例进行国家标准、行业标准与国际标准的比较及适用性评估，为动物检疫标准的制修订工作提供参考。

2 猪传染性疾病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较及适用性评估

2.1 非洲猪瘟（African swine fever）的诊断标准及适用性评估

非洲猪瘟的OIE诊断标准包括红细胞吸附试验、荧光抗体试验、病毒基因组检测、动物接种试验及ELISA、间接荧光抗体试验、免疫印迹试验和逆向免疫电泳试验，共计8个方法标准。其中红细胞吸附试验可以检测组织和外周血中的病毒，对非洲猪瘟的诊断是确定的；荧光抗体试验检测病毒抗原进行假定诊断，鉴定非红细胞吸附型毒株，鉴别ASFV和其他病毒引起的细胞病变，在亚急性和慢性病例中敏感性降低；病毒基因检测可以检测和鉴别所有已知的病毒基因型，对不适合病毒分离或抗原检测的组织特别有用；动物接种试验过去用于区别古典猪瘟和非洲猪瘟，周期长、昂贵，操作困难，引起动物福利问题，不再推荐使用；ELISA直接检测低毒力或中等毒力感染猪的ASFV抗体，用于大规模血清样品的筛选，广泛用作根除计划，特异性和敏感性都很高，有商品化试剂盒供应，是国际贸易指定使用的试验；间接荧光抗体试验用作无ASF疫区ELISA阳性血清以及ELISA结果不确定地区的确诊试验；免疫印迹试验用作间接荧光抗体试验的替代试验对有争议的血清进行确诊，特异性强，结果的解释更加容易、更加客观，能够较好地鉴别弱阳性样品；逆向免疫电泳检测用于猪群的检疫筛选，不建议用作个体猪的检疫，快速，敏感性低。非洲猪瘟诊断的国家标准包括PCR和ELISA，检验检疫行业标准包括红血球吸附试验、直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，分别相应于OIE标准中的基因检测、ELISA、红细胞吸附试验、荧光抗体试验和间接荧光抗体试验，缺失了OIE标准中的动物接种、免疫印迹和逆向免疫电泳试验，建议加强这方面的标准制修订。

2.2 猪萎缩性鼻炎（Atrophic rhinitis）的诊断标准及适用性评估

猪萎缩性鼻炎的OIE诊断标准包括病原培养、生化鉴定（荚膜分型、菌体抗原分型、毒素检测）、核酸检测及ELISA和凝集试验，共计7个方法标准。其中病原培养可以从病料中直接分离病原菌，荚膜分型试验使用间接血凝进行血清分型，用于流行病学调查，只有少数实验室可以做；菌体抗原分型可以区别16个抗原型，很多参考实验室和一些诊断实验室都可以做；产毒性鉴定是诊断的依据，是鉴别带菌猪和控制萎缩性鼻炎的首选方法，特异性强；核酸检测用于检测病原菌和荚膜分型，限制性内切酶是流行病学调查的首选方法，快速、特异和敏感；还没有满意的血清学试验可用于检测感染动物，产毒菌株和非产毒菌株有交叉反应，抗体检测无意义，有商品化的检测多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂供应；凝集试验可以检测支气管败血波氏杆菌，但病原在明显健康猪群中持续存在，只能用于监控阴性畜群的健康地位。猪萎缩性鼻炎诊断的农业行业标准包括病原分离培养、荚膜分型、菌体抗原分型、毒素鉴定以及试管凝集、平板凝集，与OIE标准中的病原培养、生化特征鉴定以及血清凝集试验相对应，缺少了OIE标准中的核酸检测和ELISA试验；目前还没有相关国家标准和检验检疫行业标准，建议加强这方面的标准制修订。

2.3 猪瘟（Classical swine fever）的诊断标准及适用性评估

猪瘟诊断的OIE标准包括荧光抗体试验、过氧化物酶免疫染色、抗原捕获ELISA、病毒分离鉴定和反转录聚合酶链反应5种病原鉴定方法以及过氧化物酶中和试验、荧光抗体病毒中和试验与单抗ELISA三种血清学方法，共计8个方法标准。其中荧光抗体试验是检测冷冻切片上的病毒抗原，阴性结果并不能完全排除CSFV感染，建议专业实验室使用；过氧化物酶染色可以区分田间分离株和疫苗免疫株，区别CSFV和其他瘟病毒；抗原捕获ELISA筛选最近可疑感染的畜群以便能够快速诊断，操作简单，不需要组织培养设备，适合于自动化，敏感性不如病毒分离，特异性差，不适于个体诊断；病毒分离比免疫荧光试验更加敏感，周期长；RT-PCR可以成功地控制疾病暴发，快速，比抗原捕获ELISA或病毒分离更加敏感，特别适合于临床前诊断，是欧盟和许多国家认可的快速筛选方法，初次阳性结果要通过其他方法确诊；过氧化物酶中和试验用于国际贸易目的和国家监测计划，是最常用的抗体检测技术之一，结果容易判读，是国际贸易指定使用的试验；荧光抗体病毒中和试验是常用的抗体检测技术之一，是国际贸易指定使用的方法，稀释度低时偶尔会产生交叉反应；单抗ELISA主要用于猪瘟抗体的鉴别诊断，可区别自然感染猪、免疫猪、强、弱毒抗体阳性猪和抗体阴性猪，敏感性非常高，是国际贸易指定使用的试验。猪瘟诊断的国家标准包括兔体交互免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与鉴定、直接免疫荧光抗体试验、反转录聚合酶链反应以及荧光抗体病毒中和试验与猪瘟单抗ELISA，其中的兔体交互免疫试验是对国际标准的补充；检验检疫行业标准包括免疫荧光技术、中和免疫荧光试验以及单抗ELISA，分别对应于OIE标准中的荧光抗体试验、过氧化物酶免疫试验、病毒分离、RT-PCR、荧光抗体病毒中和试验及单抗ELISA，缺失了OIE标准中的过氧化物酶中和试验及抗原捕获ELISA。

2.4 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）的诊断标准及适用性评估

猪繁殖与呼吸综合征诊断的OIE标准包括病毒分离、核酸检测、免疫组化、免疫过氧化物酶单层试验、间接免疫荧光试验和间接ELISA，共计6个方法标准。其中病毒分离可以鉴定病毒，但比较困难；核酸检测用于不适合做病毒分离的样品，可以区分不同分离株，区别田间株和疫苗株，进行分子流行病学研究，快速、不需要细胞培养设备；免疫组化检测组织中的病毒抗原，免疫过氧化物酶试验检测血清中的病毒抗体，间接免疫荧光试验用于滴定血清抗体滴度，还没有可以被广泛接受的标准，主要用于北美洲国家；间接ELISA可以区分不同分离株，确定猪群的感染地位，操作简单，在群体水平上特异敏感，可以快速处理大量样品，有商品化试剂盒供应。检验检疫行业标准包括病毒分离、免疫过氧化物酶单层试验、间接免疫荧光试验和间接ELISA，农业行业标准包括免疫酶试验和免疫酶组织化学法，只是缺失了OIE标准中的核酸检测，其余方法都与OIE标准相对应，国家标准目前还是空白，建议将相关行业标准上升为国家标准。

2.5 猪水泡病（Swine vesicular disease）的诊断标准及适用性评估

猪水泡病诊断的OIE标准包括病毒分离与鉴定、ELISA检测抗原、核酸检测、病毒中和试验以及ELISA检测抗体，共计5个方法标准。其中病毒分离与鉴定是鉴定病毒的参考方法，不足以用ELISA和RT-PCR检测的样品需要进行病毒分离；间接夹心ELISA检测病毒抗原已经取代补体结合实验成为首选方法，适合于快速筛选，具有与病毒分离同样的诊断价值；核酸检测从临床和亚临床病例中检测病毒基因组，适合于快速筛选，具有与病毒分离同样的诊断价值；病毒中和试验用于实验室确诊、血清学监测和猪的出口认证，常用的血清学检测技术之一，得到认可的标准方法，耗时长，是国际贸易指定使用的方法；ELISA抗体检测用于实验室确诊、血清学监测和猪的出口认证，常用的血清学检测技术之一，快速，容易标准化，单抗竞争ELISA是检测病毒抗体的可靠技术。相关国家标准包括病毒分离鉴定、反向间接血凝试验、琼扩、病毒中和试验以及荧光RT-PCR，其中反向间接血凝试验和琼扩试验是对OIE标准的补充，都适用于大批样品的筛选，适用于检疫、监测、流行病学调查和无本病猪群的建立，缺失了OIE标准中的ELISA抗原、抗体检测技术；检验检疫行业标准只有一个病毒中和试验，建议申请反向间接血凝和琼扩试验的国际认证，加强和完善其他缺失方法的标准制修订。

2.6 猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis）的诊断标准及适用性评估

猪传染性胃肠炎诊断的OIE标准包括病毒分离、荧光抗体检测、双抗体夹心ELISA、核酸检测、病毒中和试验、阻断或间接ELISA，共计6个方法标准。其中病毒分离是除活猪接种之外最确定的诊断方法，费时费力，不适合于常规检测；荧光抗体检测鉴定病毒抗原，快速、敏感、特异性强；双抗体夹心ELISA可以检测粪便中的病毒抗原，核酸检测可以直接检测临床样品中的病毒；病毒中和试验很多年来得到非常广泛的使用，通常作为评价其他新方法的标准；阻断或间接ELISA可以与猪呼吸道冠状病毒进行鉴别诊断，是出口检疫的首选方法，有商品化试剂盒供应。检验检疫行业标准包括阻断ELISA、血清中和试验，农业行业标准包括病毒分离鉴定、直接免疫荧光法、双抗体夹心ELISA、中和试验、间接ELISA，这几个方法都与OIE标准相对应，只是缺失OIE标准中的核酸检测，核酸检测具有快速、灵敏等优点，建议加强这方面的标准制修订任务，同时加快行业标准向国家标准的升级转化。

2.7 诊断标准与OIE标准差距很大的几种猪传染性疾病

OIE所列猪传染性疾病共有11种，除上述6种之外，其他5种我国都没有相关国家标准或行业标准，与OIE标准差距很大。这5种疾病包括尼帕病毒性脑炎（Nipah virus encephalitis）、猪布氏杆菌病（Porcine Brucellosis）、猪 囊 虫 病（Porcine cysticercosis）、猪 流感（Swine infl uenza）、猪肠道病毒醒脑脊髓炎 /捷申 病（enterovirus encephalomyelitis/ Teschen/Talfan disease），这5种疾病的OIE标准都比较完善，但我国却没有这方面的标准，特别是尼帕病毒性脑炎是新发外来传染病，传染性很强，我们必须做好技术储备防治外来并入侵。猪流感病毒是人畜共患传染病，特别是今年甲型H1N1流感病毒在世界范围内的流行更加剧了本病的严重危害性，建议加强这方面的标准制修订任务。

2.8 超出OIE标准范围的几种猪传染性疾病

根据我国动物疫病发病的实际特征，结合我国具体情况，研究人员还制定了没有列入OIE标准但是在我国比较严重的几种猪传染性疾病，包括猪细小病毒病、猪流行性腹泻和猪传染性胸膜肺炎等。有关猪细小病毒的标准有猪细小病毒红细胞凝集抑制试验与聚合酶链反应；有关猪流行性腹泻的标准有病毒分离鉴定、直接免疫荧光试验、双抗体夹心ELISA、血清中和试验、间接ELISA以及间接Dot-ELISA，内容比较丰富完善；有关猪传染性胸膜肺炎的标准包括聚合酶链反应和阻断ELISA。这些技术如果成熟，建议申请国际标准认可。

3 比较、评估结论与建议

通过比较发现，我国猪传染性疾病的诊断标准与国际标准存在的差异比较大。具体表现在：（1）有一些标准是OIE手册中没有提及的，如猪细小病毒的红细胞凝集抑制试验与聚合酶链反应，猪流行性腹泻的病毒分离鉴定、直接免疫荧光试验、双抗体夹心ELISA、血清中和试验、间接ELISA以及间接Dot-ELISA等，以及猪传染性胸膜肺炎的聚合酶链反应和阻断ELISA等。这些标准都是我国相关科研单位根据国家疫病发生的实际情况制定的。这样做提升了标准的适用性，更加符合疫病防控的迫切需要，是对国际标准的补充，如果技术成熟，建议可以申请成为国际标准。（2）有一些标准内容比较全面，技术含量高，科学性强，具有一定的先进性，与国际标准比较接近，可以满足国际贸易的需要。（3）有一些标准内容不全面，只包括了OIE标准中的部分内容，落后于国际标准，特别是OIE推荐的国际贸易规定要使用的方法在我国缺失，这类标准要加快修订和更新，以便能适应国际贸易的需要。（4）有一些标准与国际标准差距很大，比较成熟的国际标准在我国还是空白，如，尼帕病毒性脑炎、猪布氏杆菌病、猪囊虫病、猪流感及猪肠道病毒醒脑脊髓炎/捷申病。一旦遇到国际贸易要求对这些疾病进行检疫，我们将无法应对，陷入被动，建议必须加快这方面的标准制修订任务。（5）有一些行业标准与国家标准的内容相互交叉、重复甚或矛盾，这种情况需要进行清理整合。

鉴于上述猪传染性疾病诊断的国家标准、行业标准与国际标准存在的差距，建议（1）从OIE参考实验室引进重大动物疫病的诊断试剂和方法，选取国内资质条件好的实验室对目前我国已经制定的动物检疫标准进行验证和复核。验证合格者，推荐使用，并推荐申请OIE的国际认可；验证有小幅差距者，暂停使用，待完善达标后再推荐使用；不合格者，停止使用，撤消标准。这样做有利于提高我国口岸动物检疫实验室的水平，有利于我国动物检疫标准与国际标准同等地位的确立，可以推动我国动物及动物产品的出口贸易，同时更好地防范外来动物疫病入侵，更好地把好国门。（2）遵照OIE标准的要求，制定一个系统、完整的国家标准或行业标准制定体系或框架，在该体系或框架的指导下，对现有标准进行清理整合、特别是对于那些内容交叉重复甚或矛盾的部分进行彻底清理，内容陈旧的标准进行更新修订，过期或不适用的标准进行作废处理，缺失的标准加紧制修订，使我国的标准制修订工作逐步进入一个有序状态，按计划进行。

[1] 马贵平，史喜菊，李冰玲，等.多种动物共患传染病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较及适用性评估[J].中国动物检疫，2010，27（10）：66-69.

[2] 史喜菊，马贵平，李冰玲，等.牛传染病诊断的国家标准、行业标准与国际标准的比较及适用性评估[J].中国动物检疫，2010，27（11）：64-67.

[3] World Organization for Animal Health（OIE）.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals，2011[M/OL].http：//www.oie.int/international-standard-setting/terrestrialmanual/access-online/.