注射载药微球表面修饰研究进展

张绪君 ，卢婷利 ，陈 涛 ，2，高迎春 ，赵 雯

近年来，随着生物技术和基因工程的发展，越来越多的蛋白质、酶有望用于疾病治疗。目前已有超过300种蛋白质药物批准上市或进入临床研究[1]。然而，由于蛋白质、酶类药物口服后在肠道中易降解，静脉注射体内循环时间短、生物半衰期短，大大制约了其应用。为解决这些问题，出现了各种蛋白质类药物剂型，包括水凝胶、纳米球、微球、脂质复合物的脂质体、固体脂质纳米粒、油包水型乳剂等。微球以生物可降解聚合物为载体，将生物活性物质固定化后，转运到特定部位，以预定的速率和剂量发挥作用。与其他缓控释系统相比，微球具有制备较简单、稳定性好、成本低等特点，已成为近年来研究的热点[2]。近年来国内外研究的微球常以聚乳酸 －羟基乙酸共聚物[poly(lactic－co－glycolic acid)，PLGA]为骨架材料，将多肽、蛋白质类药物包裹或分散于PLGA中制成微球制剂，粒径范围一般为1～500μm[3]，给药后既能达到保护药物目的，又能随着聚合物的降解，将药物以扩散、溶蚀等方式释放，达到缓释长效的目的[4]。目前，微球制剂多数为静脉注射给药，进入血管内会从血管中迅速清除并被存在于肝、脾及骨髓等处的网状内皮系统摄取[5]，因此大部分微球药物不能有效地到达靶向部位，影响了药物的作用效果。研究表明，延长载药微球在体内的循环时间，降低微球被网状内皮系统消除的可能性，有效提高药物在体内的作用时间，关键在于提高载药微球的靶向性和延长其在靶部位的滞留时间。笔者主要从这两个方面对PLGA微球给药系统的研究进展进行介绍。

1 延长微球在体内的循环时间

微球在达到靶部位之前，在体内应该有足够长的循环时间，网状内皮系统的摄取对源于网状内皮系统的疾病治疗是有利的，但多数疾病与此系统无关。普通微球经静脉注射后会被单核吞噬细胞系统吞噬，从血中快速清除并积聚在单核巨噬系统丰盈的组织中，尤其是肝脏和脾被认为是实现药物靶向输送到人体器官组织的主要障碍。因此，避免被吞噬系统器官截留以及延长体内存留时间，成为微球制剂的研究热点。微球的粒径和表面性质(电荷、亲水性等)是影响微球被单核吞噬细胞系统清除的主要因素[5]。因而，控制微球粒径和改变微球的表面性质是延长药物在体内循环时间的主要途径。

1)粒径因素

粒径和粒径分布是微球性质的诸多评价指标中两项重要的指标，对于微球的包封率和释放行为有着显著影响，更是进行微球表面修饰的前提条件。减小微球的粒径，能增加其在靶部位的聚集，并同时延长其在血液中的半衰期。相同聚乙二醇单甲醚(mPEG，相对分子质量为5 000)修饰微球时，随着粒径的减小，巨噬细胞吞噬量减小，大鼠血浆半衰期延长。同时，粒径范围也影响到网状内皮系统的摄取作用，微球粒径越小，粒径范围越窄，越有利于灵活用药，并能增加生物利用度和降低给药剂量，提高可控释性[3]。因此，应根据组织、靶点、循环时间来优化微球的最佳粒径。同时，还需要选择合适的包埋方法，如乳化溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法和乳化交联法等。但这些传统的微球制备方法存在着粒径不均一、粒径难控的缺点，给实际应用带来很大困难。

近年来出现了许多新的制备方法，Kluge等[5]应用超临界液体乳化技术(supercritical fluid extraction of emulsions)，通过改变PLGA浓度与制备初乳阶段的搅拌速度获得的溶菌酶微球平均粒径在100 nm与几微米之间，不但分布范围窄，而且具有重复性与粒径可控性。Kang等[6]根据文献报道，改进了超临界流体技术(supercritical fluid techniques)，采用超临界流体快速分散溶液技术制备平均粒径为 1.65 μm(跨度为 0.831)的 PLLA/PLGA空白微球，和平均粒径为2.35μm(跨度为0.914)的吲哚美辛－PLLA/PLGA微球。

2)微球表面修饰

使微粒长循环和靶向性的主要方法是表面修饰，如非离子表面活性剂包衣和聚乙二醇修饰。巨噬细胞消除外来粒子的一个主要机制是通过识别结合于微粒上的免疫球蛋白G(IgG)的Fc段和补体，来吞噬抗体结合的微粒。将微球表面修饰上亲水基团，可以改变微球表面的疏水性，同时利用位于表面的聚合物链的空间效应，减少血浆蛋白在微球表面的吸附，避开肝巨噬细胞尤其是枯否细胞(Kupffer cell)的识别和吞噬，延长在血液中的循环时间。PLGA因具有优良的生物相容性及可降解性而在医用生物材料中得到了广泛应用，然而由于其表面缺乏细胞识别位点，以及存在亲水性和细胞亲和性不足等缺点，影响了细胞在其表面的黏附生长。为了得到生物功能和亲水性均较理想的PLGA，通常应用物理或者化学的方法在材料中引入其他分子对其进行改性，赋予材料生物信号，以提高其适用性。

(1)聚乙二醇共价偶联修饰

共价偶联修饰是将表面修饰物质与载体材料通过一定的化学反应键合，然后制备微粒。作为外源异物的微球被巨噬细胞吞噬，始于内源蛋白与微球的非特异性结合。将聚乙二醇等亲水性聚合物通过酯键共价连接到微粒载体上，可得到较稳定的包衣层。最常见的聚乙二醇是线性或分支的，末端带有的羟基具有伯醇性质，能进行酯化和醚化反应[7]。将聚乙二醇长链与PLGA共价结合，增加聚乙二醇分子量可使纳米粒与单核吞噬细胞系统相互作用减弱，循环时间更长[8]。经聚乙二醇修饰的共聚物纳米粒，由于聚乙二醇在纳米粒表面形成聚乙二醇束起到空间位阻作用，与未经修饰的相比，可降低血液中调理素蛋白在纳米粒表面的吸附等作用，阻断或延迟单核吞噬系统对纳米粒的识别吞噬，延长药物在循环系统的滞留时间，改变其在在血液和肝、脾等单核细胞丰富的器官中的分布[9－10]。

聚乙二醇是亲水、非离子性的高聚物，具有良好的生物兼容性，是目前避免单核吞噬细胞系统清除作用和延长脂质体在血液中驻留时间的最常用试剂。聚乙二醇嫁接在蛋白质、肽以及非肽类分子上，具有无毒、无免疫性、不产生抗原和水中稳定等优点，并已通过美国食品药物管理局(FDA)认证。聚乙二醇分子可以通过多种途径被引入纳米粒，如在纳米粒制备过程中通过共价键键合(即化学嫁接技术)或者利用纳米粒的表面吸附作用结合等[7]。修饰后的药物或载药微粒具有滞留时间长、降解作用弱、免疫可能性低等优点。聚乙二醇修饰使多肽、蛋白质类药物得到了较广泛的应用。

除了能延长在体循环中的驻留时间外，纳米粒表面的聚乙二醇还能够起到其他作用，例如减少蛋白质和酶在其表面的吸附，从而减缓PLGA的生物降解速度。通过改变聚乙二醇的密度和相对分子质量，可以控制表面吸附的蛋白质量处于最小值。采用聚乙二醇改性后，聚乳酸纳米粒在模拟胃液中的稳定性增加。采用模拟胃液处理4 h后，9%聚乳酸纳米粒转化为乳酸盐，但改性后的聚乳酸纳米粒只有3%的转化率。

全灵东等[11]以PLGA经mPEG修饰后的三嵌段共聚物mPEGPLGA－mPEG(PELGE)制备静脉注射用胰岛素纳米粒，聚乙二醇含量为5% ～10%时，包封率达到了94% ～98%，载药量为4.48% ～4.67%。对纳米粒进行聚乙二醇修饰后，改变了聚合物表面的亲水性和柔顺性，形成亲水嵌段外壳而不被网状内皮系统摄取与肝、脾、肺快速清除，延长了胰岛素在血液循环中的停留时间。

在PLGA分子中，可同时引入氨基酸和聚乙二醇。为从分子结构上改善PLGA材料的亲水性和细胞黏附性，罗丙红等[12]以辛酸亚锡为催化剂、聚(聚乙二醇 －co－L－天冬氨酸)交替预聚物(PEG－ASP)n引发剂引发 D，L－丙交酯和乙交酯开环共聚，合成带有功能侧氨基的PLGA－(PEG－ASP)n共聚物，通过细胞黏附试验比较，该共聚物的亲水性以及对骨髓基质细胞的黏附能力和黏附效率均明显优于未修饰的PLGA，有望成为一种良好的可降解吸收组织工程支架材料以及骨靶向药物缓释载体。

(2)表面活性剂表面吸附修饰

通过物理吸附的原理，将某些表面活性剂吸附到纳米粒表面也可达到长循环的目的。主要采用非离子型聚氧乙烯类表面活性剂，最常用的是泊洛沙姆及其乙二胺衍生物。非离子表面活性剂包衣纳米粒长循环的机制是，不带电荷、亲水性表面的包衣层以及聚合物的立体排阻效应阻断了纳米粒与巨噬细胞的吞噬过程[13－14]。亲水性的包衣能减少纳米粒对血中成分的吸附(如opsonin，apolipoprotein)，从而降低血浆蛋白的调理作用。表面活性剂吸附层厚度增加，吞噬细胞的吞噬功能则下降，一般认为表面层的厚度大于10 nm，能有效发挥空间位阻作用。

王杰等[15]用3H－环孢菌素A制备了平均粒径为59 nm的聚乳酸纳米粒，采用物理吸附的方法分别用Brij 78，Myrj 53，Myrj 59作表面活性剂对其进行了表面修饰。以小鼠腹腔巨噬细胞为体外细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，分别进行体外细胞吞噬试验和体内组织分布试验。用泊洛沙姆407和泊洛沙姆908包衣的PLGA粒子能延长药物的半衰期，载药纳米粒给药1 h后仍有30%药物存留在血液循环中，而游离药物给药5 min后用药者血液中只剩8%。

其他用以表面改性的试剂包括聚山梨醇酯－20、聚山梨醇酯 －60、聚山梨醇酯 －80、Brij 35、Brij 78、羟丙基纤维素、壳聚糖、薄荷醇等。分别以BrU 78，Myrj 53，Myrj 59表面改性剂对载环孢菌素的聚乳酸纳米粒进行表面改性。结果显示，随着表面改性剂亲水性的增加，巨噬细胞对纳米粒的吞噬作用减弱。采用壳聚糖表面改性的PLGA纳米粒可以增加大分子在黏膜表面的穿透性，增加纳米粒的正Zeta电势和破伤风类毒素的包裹效率。放射性同位素标记的破伤风类毒素实验结果表明，表面改性后的纳米粒较未经改性的纳米粒在穿过鼻和肠的上皮细胞时有好的传输能力。

2 延长微粒在吸收部位的停留时间

表面修饰除了可以延长微粒的血浆半衰期外，还可延长微粒在吸收部位的滞留时间。如通过连接配基、抗体、酶等，能使微粒主动富集于相应受体、抗原，酶底物等所在的靶部位，使微粒具有特异靶向能力[14－16]。微粒表面上用阳离子聚合物包衣也易于被细胞摄取。

1)配体修饰

特异性单克隆抗体(mAb)是1975年发现的具有特异靶向性的抗体，将其与不同的化学药物结合，能获得具有特异靶向性的药物分子，实现药物靶向给药。然而，由于大部分药物难以与其偶联，或直接偶联会改变药物的药理作用及引起免疫反应，故常采用将药物包封于微球、脂质体等微粒中，然后用其进行表面修饰，以避免药物理化性质的改变，同时又赋予药物一定的靶向性，制备出靶向性载药系统。

双酸类化合物(diphosphonate)是天然焦磷酸的类似物，对骨组织和钙化组织有特异性的亲和力，能有效抑制骨质吸收[17]，阿仑膦酸盐是这类药物典型代表。Sung等[18]用同时接连有阿仑膦酸盐和mPEG的al－PLGA制备出纳米粒，证明其对羟磷灰石具有很强的特异吸附能力，通过改变阿仑膦酸盐的比例，进一步验证al－PLGA吸附羟磷灰石能力随阿仑膦酸盐含量的减少而减弱;同时也发现mPEG嵌段链长度过长会减弱对羟磷灰石的吸附能力。

2)生物多糖修饰

近年来，表面修饰因具有多方面的优势而受到普遍关注。多糖具有良好的生物相容性和生物降解性;多种活性基团通过共价键结合的大分子具有许多独特的理化特性(如网状结构、双亲性)，所形成的纳米粒或者胶束具有很好的稳定性，可赋予纳米粒生物黏附特性，并且能产生很好的靶向性。用壳聚糖和卡波姆等生物黏性聚合物进行纳米粒表面修饰也多见报道。

透明质酸(HA)具有良好的生物相容性、可降解性和组织黏附性，并有助于大分子穿过组织黏膜表面。Yadav等[19]用透明质酸与PEG－PLGA反应合成HA－PEG－PLGA，并以此为骨架材料按阿霉素∶PLGA=1∶1的优化处方制备阿霉素HA－PEG－PLGA纳米粒与阿霉素PEG－PLGA纳米粒，体外释放研究显示持续释放时间达15 d。将两种微球尾静脉注入模拟埃列希腹水肿瘤的小鼠，于1，2，4 h 后处死，取肿瘤，肝、脾、肺、肾、肠、心脏、胃和肌肉等组织分析标记放射性元素的分布，显示给药1 h后，透明质酸修饰的PLGA纳米粒的在肿瘤组织部位富集浓度高于未经修饰的近两倍，2 h后浓度更高，对肿瘤组织有明显的靶向性。小鼠体内肿瘤抑制试验与普通阿霉素注射剂对照，结果表明阿霉素HA－PEG－PLGA纳米粒可使肿瘤体积明显缩小。由于透明质酸是动物细胞膜成分，与单纯的聚乙二醇修饰相比，PLGA纳米粒更易黏附于肿瘤细胞，并被识别、内摄，提高了药物的渗透性。

3 结语

多肽、蛋白质类药物在临床上常用的剂型仍主要为注射用溶液剂和冻干粉针剂，给药途径单一，且必须频繁给药，患者的依从性差。微球可使药物在数周或数月内以一定速率释放是一类极具开发潜力的新型药物载体。但目前存在的很多问题，导致许多药物的微球制剂难以应用于临床，如药物包封率及载药量低，由于微球形状和体内生物降解等造成的药物非零级释放，药物难以在最合适的时间内释放;对缓释系统内药物的不同释放程序和速度的研究不足，达不到对某些疾病的综合预防和治疗标准等。其中包封率和释放是评价微球制剂的两个最重要的指标，蛋白质多肽类药物微球的包封率和释放问题最终还要通过微球修饰来解决。

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