植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密码子优化及其在毕氏酵母中的表达

李春丽，韩露，郑振宇，赵卫东

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密码子优化及其在毕氏酵母中的表达

李春丽，韩露，郑振宇，赵卫东

河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002

根据甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的成熟区氨基酸序列，按照酵母密码子的偏好优化其编码序列，合成了4对末端具粘合位点的寡聚核苷酸序列，经连接、PCR扩增后得到了179 bp的des-pGlu1-Brazzein编码序列，插入到pPIC9K载体中，构建了重组表达载体pPIC9K-Bra。经酶切、电击转化到毕赤酵母菌GS115中。酵母工程菌株经筛选鉴定后诱导表达，目的蛋白的表达量约占上清总蛋白的51.6%，分离纯化后的des-pGlu1-Brazzein具有一定的甜度。

甜蛋白，毕氏酵母，表达，活性检测

然而天然甜蛋白的开发生产受到资源、产地的限制，难以规模化生产，人工合成的甜蛋白价格昂贵，限制了它的应用。因此，利用工程技术生产des-pGlu1-Brazzein具有重要意义。由于des-pGlu1-Brazzein发现较晚，对于其基因工程的研究还较少，主要是在原核生物大肠杆菌和乳酸球菌中表达[4-5]，我们也曾经优化了des-pGlul-Brazzein的编码序列，使其在大肠杆菌得到了高效表达[6-7]。但是存在的主要问题是得到的产物以包涵体的形式存在，纯化后的 des-pGlu1-Brazzein还需要进一步的复性才具有活性。为克服这些缺点，本研究按照酵母密码子的偏爱优化了des-pGlu1-Brazzein (Bra) 编码序列，采用目前广泛使用的毕氏酵母 Pichia pastoris作为宿主菌，构建了des-pGlu1-Brazzein高效分泌表达的酵母工程菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和载体

4对编码des-pGlu1-Brazzein的寡聚核苷酸片段和2对引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PUC18-T载体购自上海生物工程公司。pPIC9K载体和GS115酵母菌株购自Invitrogen 公司。TG1菌株为本试验室保存菌株。

1.1.2 酶和试剂

T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶、限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、EX Taq酶购自大连宝生物工程有限公司。PCR纯化试剂盒购自赛百胜公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

MD培养基：1.34% YNB，0.000 04%生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂；

MM培养基：1.34% YNB，0.000 04%生物素，0.5%甲醇，1.5%琼脂；

BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，0.000 04%生物素，1%甘油，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液pH 6.0；

BMMY培养基：将BMGY中的1%甘油用0.5%的甲醇替代。

1.1.4 主要仪器和设备

多功能荧光分析系统 (Eagle eye) 及其分析软件Gel-ProAnalyzer(3.1) 购自美国冷泉港仪器公司，电击转化仪购自美国伯乐公司。基因的测序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 des-pGlu1-Brazzein基因的设计合成

根据 des-pGlu1-Brazzein的氨基酸序列和酵母对密码子的偏爱设计 4对编码 des-pGlu1-Brazzein的末端具粘合位点的寡聚核苷酸片段[8-9]，每段寡核苷酸长度30~59 nt不等。正负链之间互补区至少25 nt以上。在结构基因的两端分别设置了酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ，在3′端加上2个终止密码子。合成的片段和2对引物如表1所示。

1.2.2 des-pGlu1-Brazzein基因的克隆和鉴定

除Bra-1和Bra-4′的2个5′端片段以外，其余的6个片段均用T4多核苷酸激酶磷酸化。所有片段等比例混合后94 ℃变性1~2 min室温冷却，然后加入T4 DNA连接酶于12 ℃~16 ℃连接过夜。以连接反应产物作为模板，以合成的Bra和 Bra′为上下游引物按下列条件进行PCR反应：94 ℃热变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

PCR产物纯化后，与 PUC18-T载体于12 ℃~16 ℃连接过夜后，转化TG1感受态细胞，均匀涂布于含 Amp抗性的 LB培养基上 (含X-gal、IPTG)，37 ℃培养过夜。

表1 合成的序列Table 1 The synthesized sequence

培养平板上生长的白色菌落，提取质粒进行PCR及其酶切鉴定，最后进行测序鉴定。

1.2.3 表达载体pPIC9K-Bra的构建和鉴定

将测序正确的质粒和 pPIC9K载体分别进行双酶切，1.0%的琼脂糖电泳分别回收目的基因和pPIC9K载体，而后用T4 DNA连接酶连接过夜。连接后的产物转化 TG1感受态细胞，均匀涂布于含Amp的LB培养基上。37 ℃培养过夜。

将在含Amp的LB培养基上生长的菌落培养，提取质粒同样进行PCR检测和酶切检测。最后进行DNA测序鉴定。

1.2.4 重组质粒电击转化毕氏酵母

将测序正确的载体用限制性内切酶 SalⅠ进行酶切，纯化后取10 µL转化80 µL的酵母感受态细胞，电击后立即加入冰冷的 1 mol/L山梨醇，取200~600 µL涂布于MD培养基上，2~6 d后观察转化子的生长。

1.2.5 整合转化子的筛选和PCR鉴定

挑取在MD培养基上生长的菌落，在96孔板中培养，连续转接3次，使每一个克隆的细胞密度都相同，然后分别点种10 µL于MM、MD培养基及其含不同浓度G418 (0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、 4 g/L) 的YEPD培养基上，于30 ℃培养2~3 d，筛选具有高 G418抗性且生长良好的菌株进行菌落PCR，以 AOX1和 AOX1′为引物进行检测，扩增的条件是：94 ℃ 1 min ，54 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃ 10 min。

1.2.6 表达菌株的诱导表达及电泳检测

接种单菌落于25 mL的BMGY培养基上，30 ℃培养OD600至2~6 (约16~18 h)，离心收集菌体，用等量的BMMY培养基悬浮培养，每日补加甲醇至终浓度为0.5%，诱导6 d，取样品上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，检测表达结果。

1.2.7 des-pGlu1-Brazzein的纯化和活性检测

将获得的des-pGlu1-Brazzein用透析袋透析，80 ℃加热 30 min后离心以获得小分子量的des-pGlu1-Brazzein，SDS-PAGE检测纯化的情况。通过 6人品尝，确定纯化后的 des-pGlu1-Brazzein的甜度[6]，即将纯化的 des-pGlu1-Brazzein采用BCA测定浓度，而后调整其浓度为 0.02%的母液(即1 mL水中含0.02 mg 的纯化蛋白)，进一步获得稀释成 2、4、6、8、10倍等不同稀释倍数的待测溶液。用 2%的蔗糖作为对照，通过品尝确定与之相当的甜度的des-pGlu1-Brazzein的稀释倍数。计算公式为：相对甜度=稀释倍数×100。

2 结果与分析

2.1 des-pGlu1-Brazzein的基因合成及其克隆

合成的des-pGlu1-Brazzein编码序列经T4 DNA连接酶连接后作为模板，以Bra和Bra′为上下游引物进行PCR，产物大小约180 bp，与预期相符。回收PCR产物，将其连接到T载体上，构建重组质粒T-Bra。重组质粒的PCR和酶切鉴定结果如图1所示。PCR扩增和双酶切的结果都证明目的基因连接在 T载体上。最后测序的结果表明所连接的目的基因与所设计的基因序列完全一致。

2.2 表达载体 (pPIC9K-Bra) 的鉴定

将测序正确的 T-Bra和 pPIC9K同时进行双酶切，纯化回收的 des-pGlu1-Brazzein基因片段与pPIC9K连接，构建重组载体 pPIC9K-Bra。以重组载体为模板，以AOX1和AOX1′为上下游引物进行PCR，扩增出了目的DNA片段，结果如图2A所示。图中显示，阴性对照没有扩增出任何片段，空载的质粒 pPIC9K扩增出一条约 500 bp的条带，此为AOX1基因片段 (494 bp)，pPIC9K-Bra扩增出一条约700 bp的目的条带，此为AOX1基因片段 (494 bp)加上Bra基因 (180 bp)。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pPIC9K-Bra的结果如图2B所示，箭头所示为目的条带。质粒的测序检测结果也表明，插入的基因与所设计的目的基因完全一致。

2.3 GS115-pPIC9K-Bra酵母工程菌株的筛选和鉴定

2.3.1 抗性筛选

将测序正确的pPIC9K-Bra载体用SalⅠ进行单酶切并经纯化回收后，电击转化感受态酵母细胞GS115，涂布于MD培养基上。

在MD培养基上生长的菌落经过96孔板的3次转接培养后，将每孔细胞分别点种于MM、MD培养基及含不同浓度G418的YEPD培养基上培养。筛选到的工程菌株在MM和MD的培养基上均可以生长，证明其表型为Mut+；筛选到的工程菌株在含0.25 g/L和0.5 g/L的G418平板上都可以生长，在含1 g/L的G418的平板上有50多个菌株生长。1.5 g/L时仅4株菌生长。而对照菌株GS115在G418为0.25 g/L时就不能生长。

2.3.2 PCR检测

以筛选到高G418抗性的重组子菌落为模板，以AOX1和AOX1′为上下游引物进行PCR，结果如图3所示。阴性对照未扩增出任何片段，阳性菌落对照扩增出了一条约2 200 bp的片段，此为AOX1基因。以SalⅠ酶切线性转化的菌落扩增出两条带，一条为AOX1基因 (Mut+)，一条为目的片段，箭头所示。但第 6、9泳道无目的片段，为假阳性。共得到了 30多个整合子。

图1 T-Bra的PCR和酶切鉴定Fig. 1 Identification of T-Bra by PCR (A) and enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: control; 2−4: PCR product from T-Bra. (B) M: DNA marker; 1−2: T-Bra digested with EcoR I and Not I.

图2 pPIC9K-Bra的PCR和酶切鉴定Fig. 2 Identification of pPIC9K-Bra by PCR (A) and enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: control; 2: PCR product from pPIC9K; 3: PCR product from pPIC9K-Bra. (B) M: DNA marker; 1: pPIC9K-Bra digested with EcoR I and Not I.

图3 重组酵母的菌落PCR鉴定Fig. 3 Identification of recombinant yeast by strain PCR. M: DNA marker; 1: control; 2: PCR product from GS115-pPIC9K; 3−16: PCR product from GS115-pPIC9K-Bra.

2.4 GS115-pPIC9K-Bra的诱导表达

从高抗G418平板上挑取的菌落，经PCR检测后进行甲醇诱导，每隔24 h补加甲醇至0.5%。诱导表达6 d，取上清液进行SDS-PAGE电泳验证结果如图4所示。图4显示GS115-pPIC9K-Bra比对照多表达了一条约9 kDa的目的蛋白，箭头所示。表达量约占上清总蛋白的51.6%。

2.5 des-pGlu1-Brazzein的纯化和活性分析

将获得的分泌表达的上清液用透析袋透析后，80 ℃加热 30 min，离心以获得小分子量的 despGlu1-Brazzein，SDS-PAGE检测纯化的情况如图4所示，从图中可以看到，目的蛋白得到了纯化。通过品尝的方法检测，表达的des-pGlu1-Brazzein有一定的甜度，约为蔗糖甜度的200倍。

图4 表达和纯化产物的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expressed and purified des-pGlu1-Brazzein. 1−2: purified target protein; 3−4: the supernatant of GS115-pPIC9K-Bra after induction; 5: the supernatant GS115-pPIC9K after induction; M: protein marker.

3 讨论

des-pGlu1-Brazzein是目前为止所发现的甜度最高的蛋白，是一种理想的蔗糖替代品，可以满足肥胖症、糖尿病等患者对甜味的需求。但是该蛋白天然资源有限，因此，研究利用基因工程的方法生产该蛋白具有重要意义。基于大肠杆菌等原核生物表达系统的缺点，本研究采用毕赤酵母Pichia pastoris表达系统表达该蛋白，该系统具有显著的优点：酵母能高密度连续培养；外源基因整合到酵母染色体中能稳定遗传，不易丢失；具有强启动子可诱导高效表达；表达的蛋白分泌到胞外，易于纯化；具有真核蛋白所具有的后加工过程，尤其是糖基化修饰等；已有多种蛋白在该系统成功表达[10-11]。

我们按照酵母密码子的偏爱性优化了植物甜蛋白中des-pGlu1-Brazzein的密码子，构建了适合在甲醇酵母中组表达的载体，并成功实现了des-pGlu1-Brazzein在甲醇酵母中的表达。所表达的甜蛋白分泌到上清中，约占上清蛋白的51.6%左右，其他杂蛋白相对较少，基于以前研究的结果，des-pGlu1-Brazzein耐热，所以在纯化分离时我们采用热处理的方法纯化目的蛋白，这种方法简便快捷，纯化效果好，很适合大规模纯化。

表达的目的蛋白的分子量约为9 kDa，比预计的分子量大。这可能是因为所表达的肽链上的某些氨基酸残基被糖基修饰[11]。我们采用生物软件分析表达的蛋白上有一些 0-糖基修饰位点，这还有待于进一步证实。

所表达的目的蛋白纯化后经多人品尝，具有一定的甜度，约为蔗糖甜度的200倍，比报道的甜度低，其原因可能与其分子量增加有关，导致其空间结构发生变化；这可能与品尝的测定的方式具有较大的主观性有关，导致测定结果可能有较大的误差，还需要进一步分析。

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Optimization of plant des-pGlu1-Brazzein gene according to yeasty biased codons and its expression in Pichia pastoris

Chunli Li, Lu Han, Zhenyu Zheng, and Weidong Zhao
College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

According to the amino acid sequence of des-pGlu1-Brazzein, 4 pairs of oligonucleotide with cosmic site were synthesized by using yeasty biased codons. After linkage and PCR, the 179 bp code area of des-pGlu1-Brazzein was obtained and inserted into pPIC9K, which resulted in the recombinant expression vector pPIC9K-Bra. By digestion with Sal I, the lined pPIC9K-Bra was transformed into Pichia pastoris GS115 by electric shock. The results of expression indicted that the secreted target protein accounted for 51.6% of total protein in the supernatant and showed biological activity after purification.

des-pGlu1-Brazzein, Pichia pastoris, expression, biological activity

甜蛋白是从热带植物中提取的一类蛋白，其甜度高，热量低；甜味纯正，口感好；食用该类蛋白不会使体内血糖升高，不会引起口腔蛀牙，无毒副作用。目前发现的甜蛋白有7种，其中Brazzein (巴西甜) 是Ming和Hellekant从西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillion的果实中分离得到的一种甜度极高的蛋白[1]，它有一种异构体，由53个氨基酸组成(仅仅缺乏第一个氨基酸，称为des-pGlu1-Brazzein)，其甜度更高，是Brazzein的2倍，以分子量为基础进行比较，其甜度是蔗糖甜度的 4 000倍，以重量为基础进行比较，其甜度是蔗糖甜度的1 000倍[2-3]。是目前为止所发现甜蛋白中甜度最高、分子量最小、水溶性最好的蛋白，是一种具有广阔开发前景的甜蛋白。

December 2, 2010; Accepted: March 24, 2011

Supported by:Basic Research Foundation from the Education Department of Henan Province (No. 2004922043), Doctor Foundation of Henan Agricultural University.

Chunli li. Tel/Fax: +86-371-63558180; E-mail: hnclli@163.com

河南省教育厅基础研究项目 (No. 2004922043)，河南农业大学博士基金项目资助。