腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备

陆月，刘丹，张孝任，刘雪荣，沈炜，郑刚，柳云帆，董小岩,，吴小兵，高基民

1 温州医学院 浙江省模式生物技术与应用重点实验室，温州 325035

2 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052

3 北京五加和分子医学研究有限公司，北京 100176

哺乳动物细胞表达系统具有指导蛋白质的正确折叠、提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能。因此，对于用基因工程方法获得结构复杂的高等生物蛋白质具有优势。哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。CHO/dhfr缺陷型细胞表达系统是最为常用的哺乳动物表达系统，用该系统成功地获得了多种重组蛋白的高效表达[1-3]。然而，这种表达系统需要漫长的筛选加压过程才能得到高产量的稳定细胞株，故不适合于短时间内获得较大量重组蛋白。

瞬时表达系统因实验周期短，操作简便而受到青睐。常用的瞬时表达系统有 COS-7细胞系统[4]、杆状病毒载体表达系统[5]、腺病毒载体/HEK293细胞表达系统[6]等。

本实验利用重组腺病毒能高效感染哺乳动物细胞及高效表达外源基因的特点，拟建立一种不需要转染和加压筛选的腺病毒载体/BHK21细胞表达系统，并用于快速制备重组可溶性肿瘤坏死因子受体与脂联素球部融合蛋白 (sTNFRII-gAD)。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞及试剂

pBHGlox(delta)E1,3Cre骨架质粒、pDC316原始质粒、BHK21c022细胞、无血清培养基和磷酸钙共沉淀转染试剂盒由北京五加和分子医学研究所提供；L929细胞购自美国ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养；蛋白Marker购自Invitrogen公司；放线菌素 D购自 Fluka；鼠抗人脂联素单抗由谭淑萍老师提供；鼠抗人 TNFRII单抗购自abcam公司；马抗小鼠 IgG/磷酸酶标记抗体购自中杉金桥公司；BCIP/NBT购自 Calbiochem公司；重组人TNFα标准品购自北京博奥森生物技术有限公司；Superdex 200 prep grade (16/60) 购自 GE Healthcare。

1.2 融合基因的构建及重组腺病毒的产生

以融合蛋白基因 pAAV2neo-sTNFRII-gAD为模板设计引物。上游引物为5′-CGCGGATCC ATGGCG CCCGTCGCC-3′，下游引物为5′-ACGCGTCGACTC AGTTGGTGTCATG-3′，下划线处表示酶切位点，上游引物的酶切位点为 BamHⅠ，下游引物的酶切位点为SalⅠ。引物合成由Invitrogen公司完成。PCR扩增条件为：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收试剂盒回收目的片段，将片段用BamHⅠ、SalⅠ进行双酶切。再用BglⅡ和 SalⅠ双酶切载体 pDC316。BamHⅠ和 BglⅡ是同尾酶，用T4 DNA连接酶将上述目的基因片段和pDC316片段连接，转化大肠杆菌DH5α，得到重组穿梭质粒pDC316-sTNFRII-gAD。

将 pDC316-sTNFRII-gAD和腺病毒基因组质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，用磷酸钙共沉淀法进行转染。在6孔细胞培养板中接种HEK293细胞，5×105个细胞/孔，培养过夜；转染前4~6 h换新鲜培养基 (含10% FBS的DMEM培养基)；取4 µg的DNA与水混合成总体积为67.5 µL的液体加入到EP管中。然后加入2.5 mol/L CaCl27.5 µL，混匀后4 ℃孵育20 min；向EP管中贴壁加入2×HBS (4 ℃保存) 75 µL，轻柔地混匀后室温静置5 min。最后将150 µL液体加入6孔细胞培养板中，轻轻混匀。镜下观察可以看到十分细小而均匀的颗粒；37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。9 d后见到病毒噬斑，收集病变细胞和上清作为Ad5-sTNFRII-gAD毒种。

1.3 重组腺病毒的制备与纯化

将获得的Ad5-sTNFRII-gAD毒种委托北京五加和分子医学研究所进行扩增和纯化，得到滴度为1×1015vg/L的纯化病毒。用TCID50方法[7]测定腺病毒的感染性滴度。

1.4 Ad5-EGFP对BHK21c022细胞的感染

在 24孔细胞培养板中接种 BHK21c022细胞(含10% FBS的DMEM培养基)，1×105个细胞/孔，同时按梯度加入重组腺病毒Ad5-EGFP (MOI分别为0、1、10、100、1 000)，共5个孔。12 h后换成无血清培养基，继续培养48 h后，荧光显微镜下观察，在相同的曝光时间 (1/3 s) 观察各孔中细胞的荧光强弱以及细胞的形态变化。

1.5 Western blotting检测

用MOI分别为0、1、10、100、1 000的重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022细胞，12 h后换成无血清培养基。48 h后收取细胞无血清培养上清。将上清和无水乙醇按 1∶3的比例混合到一起，−70 ℃放置0.5 h。13 000 r/min 离心5 min，倒掉上清，用少量 (一般为收取上清体积的 1/10) PBS溶液溶解沉淀，用于做 SDS-PAGE及 Western blotting实验。

取10 µL浓缩10倍的上清，加入10 µL 2×上样缓冲液，100 ℃沸水煮5 min，20 µL样品上样，12%分离胶进行SDS-PAGE分离，然后用湿胶转移仪将蛋白转移至NC膜。取出NC膜，用封闭液(5%脱脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封闭NC膜1 h。弃去封闭液，加入1∶300 (用封闭液稀释) 的鼠抗人脂联素单抗或 1∶500 (用封闭液稀释) 的鼠抗人TNFRII的单抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗涤NC膜3次后，加入 1∶1 000 (用封闭液稀释) 的马抗小鼠IgG/磷酸酶标记抗体37 ℃孵育1 h。PBS洗涤NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光显色。约15~30 min后弃去显色液，用超纯水洗涤 NC膜中止反应，观察结果。

1.6 蛋白点杂交方法检测sTNFRII-gAD蛋白

用MOI为100的重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022细胞12 h后，换成无血清培养基，然后每隔48 h换液，多次收集培养液上清，进行蛋白质点杂交实验。

将每次收集的细胞培养上清各取5 µL，分别点到NC膜上，用封闭液 (5%脱脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封闭NC膜1 h。弃封闭液，加入1∶300 (用封闭液稀释) 的鼠抗人脂联素单抗，37 ℃孵育 1 h。PBS洗涤NC膜3次后，加入1∶1 000 (用封闭液稀释) 的马抗小鼠IgG/磷酸酶标记抗体37 ℃孵育1 h。PBS洗涤NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光显色。约15~30 min后弃去显色液，用超纯水洗涤NC膜中止反应，观察结果。

1.7 sTNFRII-gAD蛋白的浓缩和纯化

用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的 BHK21c022细胞来大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL，每48 h收获上清一次并换液，反复6次收取培养上清。共得到约3 L含有融合蛋白的细胞培养上清。向上清中缓慢均匀的加入硫酸铵粉末(40%，W/V)。用磁力搅拌器在4 ℃冷库中搅拌24 h。13 000× g，1 h离心后弃去上清。用少量的PBS溶解沉淀 (3~5 mL)。然后将溶液进行透析，除去多余的硫酸铵，得到重组融合蛋白的粗纯品。依据Hiload 16/60 Superdex 200 prep grade的说明书对得到的粗纯品进行凝胶过滤层析。将层析后各个收集峰进行免疫印迹分析，收集含有目标融合蛋白的峰合并获到融合蛋白纯品。

1.8 sTNFRII-gAD融合蛋白的活性测定

96孔细胞培养板中铺入 L929细胞，1.5×104~1.8×104个细胞/孔，37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。第2天，将sTNFRII-gAD融合蛋白纯品，用含放线菌素D 20 mg/L，TNFα 20 U/mL的DMEM培养液进行4倍比梯度稀释，共稀释10个梯度；弃去96孔板中L929细胞的上清，加入前面已经倍比稀释好的sTNFRII-gAD融合蛋白样品，每孔100 µL，每个梯度做3个复孔；同时加入放线菌素D 20 mg/L与TNFα 20 U/mL的DMEM培养液(两者结合杀伤性最大) 作为阴性对照。继续培养24 h后，每孔加入MTT溶液 (5 g/L) 20 µL，再培养4 h后，将96孔中的120 µL液体吸出，换入100 µL DMSO终止培养。检测各孔的OD570值[8-9]。

2 结果

2.1 腺病毒Ad5-EGFP感染BHK21 c022细胞

分别用 MOI为 0、1、10、100、1 000的Ad5-EGFP感染BHK21 c022细胞，荧光显微镜下观察。如图1所示，随着MOI的增大，荧光细胞数量和亮度逐渐增强，表明腺病毒载体能够有效转染BHK21 c022细胞，并且表达量与病毒用量呈正相关。但在MOI达到1 000时，出现细胞变长、少数细胞死亡的现象。

2.2 重组载体质粒pDC316-sTNFRII-gAD的鉴定及重组腺病毒的获得

用 XbaⅠ和 HindⅢ双酶切 pDC316-sTNFRII-gAD应得到大小为3 777 bp和1 327 bp的基因片段，SalⅠ和 EcoRⅠ双酶切应得到3 883 bp和1 221 bp的基因片段；图 2显示酶切结果与预期相符，表明重组质粒构建成功。

图1 不同MOI的rAd5-EGFP对BHK21 c022细胞的转导效率Fig. 1 Transduction efficiency of Ad5-EGFP virus at different MOI for BHK21 c022 cells.

图2 pDC316-sTNFRII-gAD质粒的酶切鉴定Fig. 2 Restriction digestion analysis of pDC316-sTNFRII-gAD plasmid. 1: DNA marker; 2: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Sal I and EcoR I; 3: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Xba I and Hind III; 4: pDC316-sTNFRII-gAD.

将重组穿梭质粒 pDC316-sTNFRII-gAD与腺病毒基因组质粒 pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，9 d后见到病毒噬斑，如图3所示。收集病变细胞和上清作为Ad5-sTNFRII-gAD毒种。大量制备和纯化获得 Ad5-sTNFRII-gAD制品。TCID50方法测定纯化的Ad-sTNFRII-gAD病毒的感染性滴度为1.58×1013IU/L。

2.3 不同MOI的Ad5-sTNFRII-gAD的表达效率

将无血清培养48 h后的细胞培养上清浓缩后进行Western blotting检测，结果如图4所示。用脂联素单抗 (图4A) 和肿瘤坏死因子单抗 (图4B) 检测都出现了一致的特异性条带，分别为sTNFRII-gAD融合蛋白的单体、三聚体和多聚体形式，其表达效率随着重组腺病毒MOI的提高而增加。

图 3 共转染 pBHGlox(delta)E1,3Cre和 pDC316-sTNFRII-gAD后产生重组腺病毒Ad5-sTNFRII-gADFig. 3 Plaques of recombinant virus Ad5-sTNFRII-gAD generated by co-transfection of pDC316-sTNFRII-gAD and pBHGlox(delta)E1,3Cre.

2.4 sTNFRII-gAD融合蛋白的持续表达

Ad5-sTNFRII-gAD感染无血清培养的 BHK21 c022细胞后，48 h收集细胞上清，连续收集6次，用蛋白点杂交方法检测其中sTNFRII-gAD的表达。用已知浓度的 sTNFRII-Fc融合蛋白作为标准品，分别稀释成100、50、10、5、1 mg/L，膜上各加样5 µL。结果如图 5所示，可见经重组腺病毒感染过的BHK21 c022细胞在2~10 d内都持续分泌较高浓度的融合蛋白。

图4 sTNFRII-gAD融合蛋白的免疫印迹分析Fig. 4 Western blotting analysis of sTNFRII-gAD fusion protein. (A) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against adiponectin. (B) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against TNFRII. Lane 1: Protein molecular weight standards; Lanes 2 to 6: Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein at 1 000 MOI, 100 MOI 10 MOI, 1 MOI and 0 MOI of Ad5-sTNFRII-gAD.

图5 蛋白点杂交分析验证融合蛋白的持续表达Fig. 5 Confirmation of continuous expression of the fusion protein sTNFRII-gAD by protein dot blotting with monoclonal antibody against TNFRII. (A) Lanes 1 to 5: positive controls at 5 µL of 100 µg/L, 50 µg/L, 10 µg/L, 5 µg/L and 1 µg/L; (B) Lanes 1 to 5: detection of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatants of BHK-21S cells after the culture of 48 h, 96 h, 144 h, 192 h and 240 h.

2.5 sTNFRII-gAD的分子筛层析纯化及生物学活性鉴定

分子筛纯化重组融合蛋白时，出现 2个比较明显的峰，如图6所示。第1个峰为外水峰 (峰1)，是分子量相对较大的高聚体峰。而第 2个峰主要为融合蛋白的三聚体峰 (峰 2)，收集该峰，并测定其对TNFα杀伤L929细胞的中和活性。结果显示，通过腺病毒表达系统生产出来的融合蛋白sTNFRII-gAD具有中和TNFα的活性 (图7)，且其抑制TNFα杀伤L929细胞的活性呈剂量依赖性。

图6 sTNFRII-gAD融合蛋白的分子筛层析Fig. 6 Map of size exclusion chromatography of sTNFRII-gAD fusion protein. Peak1: multimers of sTNFRII-gAD in external solution; Peak2: trimer of sTNFRII-gAD.

3 讨论

目前利用哺乳动物表达系统生产高生物学活性的蛋白是获得重组蛋白最为广泛的方式。其中应用最普遍的是 CHO/dhfr−表达系统[10-11]。CHO细胞很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的表达和分离纯化，而且表达的外源蛋白保持天然的空间结构和生物学活性。所以 CHO表达系统常用于长期稳定表达重组蛋白。但是得到高效稳定表达重组蛋白的 CHO细胞株需要漫长的加压过程，不能满足短期快速得到蛋白纯品的要求。

图7 sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性测定Fig. 7 TNFα neutralizing activity of the purified sTNFRII-gAD fusion protein.

病毒载体因能高效感染宿主细胞及表达外源基因而被用于瞬时高效表达[12]。常用的病毒载体有杆状病毒载体、甲病毒SFV (semliki森林病毒) 载体、腺病毒载体等。其中腺病毒表达载体系统因安全性好、高效感染哺乳动物细胞、高效表达外源基因等优点而在重组蛋白制备方面得到应用。尤其是该表达系统对重组蛋白的糖基化、磷酸化等翻译后加工等过程与人体天然过程相似，因此表达的蛋白具有高生物活性[13-14]。

sTNFRII-gAD融合蛋白是一种双功能蛋白质分子，sTNFRII可以与TNFα结合，减轻炎症的发生，达到治疗类风湿性关节炎等疾病的目的。已经上市的 TNFα拮抗药物 sTNFRII-Fc是二聚体形式的sTNFRII。但 TNFα天然状态下是三聚体形式，重组蛋白sTNFRII-gAD是利用了脂联素球部自动形成三聚体的特性而设计的，预计获得的三聚体化sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性将比二聚体化 sTNFRII-Fc更高。本研究尝试用重组腺病毒载体/BHK21细胞表达系统来制备三聚体化的sTNFRII-gAD融合蛋白。

制备腺病毒载体最常见的生产细胞是 HEK293细胞[15]，它能够反式提供E1基因功能，使E1基因缺失的重组腺病毒能够高效复制和产生子代病毒，在这个过程中外源基因也得到高效表达。故目前也常用腺病毒载体/HEK293细胞来生产重组蛋白[16]。然而，利用重组腺病毒感染HEK293细胞会产生明显的细胞病变，只能一次性收获产物，而不能较持续地表达外源蛋白及反复多次收获细胞上清来制备目标蛋白。另外利用HEK293细胞生产重组蛋白的同时，会产生子代病毒，具有感染性，并且病毒自身的蛋白会影响重组蛋白的纯化。

本研究采用了 BHK21细胞作为重组蛋白的生产细胞。BHK21c022细胞是一种从BHK21细胞中单克隆化挑选并且无血清驯化的悬浮适应细胞株，生长迅速，适应性强，既可以在含有血清的培养液中贴壁生长，又可以在无血清的培养液中悬浮生长。为了观察腺病毒载体对于 BHK21c022细胞的转染和表达效率以及细胞毒性，我们用不同量的rAd5-EGFP病毒感染BHK21c022细胞，结果发现：虽然该细胞是小鼠来源的细胞，但对rAd5-EGFP病毒感染仍然十分敏感，并且感染和表达效率随着病毒MOI的增加而明显增加。细胞毒性只有在很高的用量 (MOI=1 000) 时才明显 (图1)。这为我们建立腺病毒载体/BHK21细胞表达系统以及选择病毒的用量提供了依据。

同理，我们构建并重组获得了 rAd5-sTNFRII-gAD病毒。用该重组病毒感染BHK2c022细胞，在上清中成功检测到了 sTNFRII-gAD融合蛋白的表达，并且发现：rAd5-sTNFRII-gAD病毒用量的增加，上清中的 sTNFRII-gAD表达量也呈明显增加趋势(图4)；利用转瓶培养，在换成无血清培养基后连续培养了 12 d，反复 6次收集上清；且 6次上清中sTNFRII-gAD蛋白表达量相对稳定 (图5)，这说明腺病毒载体表达系统可以短期稳定表达重组蛋白。另外。用复制缺陷型腺病毒载体感染BHK21c022细胞，再用LK021培养液进行培养，由于LK021是无血清、无蛋白和多肽的化学成分限定的培养液，收获的培养上清中杂蛋白很少，对纯化非常有利。因此，BHK21c022细胞是用腺病毒载体表达系统表达重组蛋白的理想细胞株。

总而言之，本实验建立了一种用腺病毒载体/ BHK21细胞系统表达和制备重组 sTNFRII-gAD融合蛋白的方法，从而为快速高效获得较大量 (毫克级)、结构复杂并具有生物学活性的重组蛋白提供了有力工具。

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