猪羊水干细胞特异向跳动心肌细胞诱导分化

陈家欢，魏育蕾，彭莎，王华岩

西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心，杨凌 712100

目前，有关羊水干细胞向心肌细胞诱导分化的报道不多，而猪羊水干细胞 (Porcine amniotic fluid stem cell，pAFS) 向心肌细胞诱导分化的研究还未见有报道。同时，猪在生物物理和生物化学上与人有很多相似之处，因此体外诱导 pAFS向心肌细胞分化，对临床上进行细胞治疗与器官移植具有重要的意义。

羊水干细胞的分化能力介于胚胎干细胞和间充质干细胞之间，具有向三胚层细胞分化的能力[1]，可以在一定条件下，诱导分化成为脂肪细胞[1-3]、神经细胞[1]等。羊水干细胞既可以从产前诊断的羊水中提取，也可以从产后的羊水中分离得到。由于抽取羊水的过程既不会像骨髓间充质干细胞的制备那样损伤供体，也避免了胚胎干细胞获得过程中存在的相关伦理之争[4]。因此羊水干细胞较骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞具有更大的优越性。

心血管疾病已成为威胁人类健康的一大杀手，而成年哺乳动物心肌细胞再生能力极差，心肌细胞损伤坏死后由纤维组织替代，导致心脏的收缩舒张功能障碍，最终导致慢性心力衰竭的发生[5]。如何使心肌细胞在数量及功能上得到补偿，是心血管疾病研究所面临的一个难题。有研究报道，向受损心肌局部移植有功能的细胞，使其在心肌梗死区增殖分化为肌组织，可以增加有功能的肌细胞数量，改善心肌功能[6]。

目前，用于研究的替代细胞主要有：胎儿心肌细胞、成年心肌细胞、胚胎干细胞以及骨髓间充质干细胞等[7-9]。但是这些替代细胞因来源不足 (如胎儿心肌细胞、成年心肌细胞)，对供体损伤性大 (如采集自骨髓的间充质干细胞) 和伦理学问题 (如来自早期发育的囊胚的胚胎干细胞) 而受到一定限制。因此寻找新的干细胞来源，已成为亟待解决的问题。本研究用不同浓度的 5-氮胞苷 (5-azacytidine，5-aza) 和 (或) 维生素C (Vitamin C，Vc) 诱导pAFS向心肌细胞分化，并通过免疫荧光染色、RT-PCR、透射电镜等技术分析诱导得到了跳动心肌细胞团，旨在建立一个由pAFS向心肌细胞分化的有效方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

α-MEM、PBS、胎牛血清 (Fatal bovin serum，FBS)、谷氨酰胺 (Gibco公司)，胰蛋白酶、5-aza、Vc、青霉素、链霉素 (Sigma公司)，Trizol (Invitrogen公司)，反转录试剂盒、Taq酶 (Fermentas公司)，一抗 anti-α-actin (Sigma公司)，一抗 anti-Tnni3 (Abcam公司)，绿色荧光标记二抗Fitc与红色荧光标记二抗cy3 (北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.2 pAFS的分离培养

从怀孕的八眉猪子宫采集样本，带回实验室后，在无菌环境下抽取猪羊水，置于无菌离心管中，1 500 r/min离心 10 min后去上清，用双抗PBS (100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素) 重悬后再次离心，如此反复 2次后将细胞接种至 ACM培养液中(α-MEM+10% FBS+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素)。细胞在38 ℃、5% CO2条件下培养5~12 d后，可见有细胞贴壁，长到80%满时进行传代培养，然后每 2天传代一次[10-11]。本实验中主要采用P10至P15代的细胞。

1.3 类胚体 (Embryoid bodys，EBs) 的形成

将 pAFS细胞按 1×106/mL密度接种到直径3.5 cm的非贴壁塑料培养皿中 (此为第0天)，于38 ℃、5% CO2饱和湿度悬浮培养，每6 h小心摇晃吹打，避免类胚体之间聚集和贴壁，每隔1 d，半量换液。培养3 d后，对形成的类胚体进行观察拍照。

1.4 pAFS向心肌细胞的诱导分化

为了诱导pAFS向心肌细胞分化，我们以ACM培养液为基础，制备了5种诱导条件培养液，包括：1# ACM+0.1 mmol/L Vc、2# ACM+0.1 mmol/L Vc+10 µmol/L 5-aza、3# ACM+10 µmol/L 5-aza、4# ACM+0.1 mmol/L Vc+5 µmol/L 5-aza-d和5# ACM+ 5 µmol/L 5-aza。以常规ACM培养液作为对照组。在向心肌细胞诱导过程中，采用了两种不同的诱导方式：第一种方式，在EBs悬浮培养5 d后将EBs收集在离心管中，在重力作用下使EBs自然沉降到管底部，去除上清后，将EBs再次接入新的3.5 cm非贴壁塑料培养皿中，继续悬浮培养，此时将培养液更换为上述1#~5#条件诱导液，继续悬浮培养2 d后，于体视显微镜下挑选体积较大，边缘整齐，结构紧密的EBs于48孔板中贴壁培养 (2~3个EBs/孔)。此时将心肌细胞诱导液更换为常规培养液ACM，对照组则一直采用 ACM培养液培养。第二种方式，EBs持续在ACM培养液中悬浮培养，于第7天，将EBs转入48孔贴壁培养板培养 (2~3个/孔)，此时将培养液更换为上述1#~5#条件诱导液。加入诱导液2 d后弃掉诱导液，细胞在常规培养液ACM中继续进行诱导分化培养。上述实验处理每组平行重复3次。在光学显微镜下每天观察记录培养板中是否会出现跳动的细胞团，如出现则被认为是成功分化的心肌细胞的功能标志。作为心肌细胞分化效率指标，详细记录诱导心肌细胞的跳动频率、跳动持续时间，以及不同条件下节律性跳动细胞团占总 EBs数目的百分比。同时对跳动部位的细胞团进行显微摄像，记录其收缩情况。跳动细胞团所占比例在 3个独立的实验中进行统计。数据采用均数和标准差表示，使用t检验进行分析。

1.5 免疫荧光检测

对发生节律性跳动的细胞团进行免疫荧光染色，采用的方法是，细胞团经 4%多聚甲醛固定 10 min后，PBS洗涤3次，然后在0.2% Triton X-100/PBS中处理10 min，再用PBS洗涤3次，每次5 min，然后在5% FBS/PBS中室温封闭0.5 h。用1∶100稀释的一抗 (α-actin，Tnni3) 4 ℃孵育过夜，再次PBS洗涤，然后加入 FITC或 cy3标记的二抗(1∶200) 37 ℃孵育1 h，经Hochest33342 (5 µg/mL PBS) 染核1 min后在荧光显微镜下观察拍照。

1.6 RNA提取和RT-PCR

取贴壁培养 10 d的跳动心肌细胞团，按照Invitrogen公司Trizol试剂说明书，抽提总RNA。并对所得的 RNA进行定量测定，A260/A280比值均在1.8~2.0之间，说明提取的 RNA纯度高，可用于实验。取5 µg RNA于含200 U M-MuLV反转录酶的20 µL反应体系中反转录。20 µL反转录产物直接用于 PCR检测。检测心肌细胞特异性的基因包括：Tbx5、α-MHC、Tnni3、Gata4等，以 β-actin为内参。RT-PCR反应循环参数为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共计35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。实验中采用的引物见表1。

表1 用于本研究的PCR引物序列Table1 Target primers used in this study

1.7 电镜观察

EBs贴壁培养10 d后，选取节律性跳动心肌细胞团收集于1.5 mL离心管中[12]，1 500 r/min离心10 min后去上清，自管壁小心加入3%戊二醛固定液，将离心下来的细胞团固定后送往第四军医大学中心实验室，进行透射电镜镜检，观察细胞内超微结构。

2 结果与分析

2.1 猪pAFS细胞分离培养及诱导分化

从猪羊水中分离的细胞经过5~12 d时间培养，出现的原代细胞形态主要为类上皮样和类成纤维样细胞 (图1A)。随着传代次数增加，类上皮样细胞逐渐减少直至消失，留下的为成纤维样细胞 (图1B)，经过细胞生物学和分析生物学检测，这种成纤维样间质细胞为猪pAFS细胞[11]。

培养pAFS细胞密度达80%以上时，用胰酶消化后接入非贴壁的培养皿中悬浮培养24 h，此时形成的类胚体 (EBs) 体积较小，结构较疏松。EBs悬浮培养 7 d后，边缘整齐，结构致密 (图 2A)。将EBs接到贴壁培养皿中培养，24 h后EBs呈贴壁生长 (图2B)，5~7 d后，贴壁生长的EBs周围迁出大量长梭形细胞，有部分细胞呈排列性生长 (图2C)。在部分 EBs周围可发现迁出的细胞会形成新的细胞克隆团 (图 2D)。对诱导分化形成的细胞团进行观察发现，能够出现节律性心肌跳动现象。细胞团跳动频率从20次/min~110次/min不等，其中大部分细胞团跳动频率处在 60~90次/min。频率小于60次/min或多于 100次/min的跳动细胞团都比较少。跳动的细胞团能够持续跳动9 d左右。

2.2 Vc/5-aza对pAFS向心肌细胞分化的影响

猪 pAFS细胞在体外能够自发分化为心肌样跳动细胞，但分化效率很低，仅为5.5%。分别用5-aza和Vc处理的EBs，均能得到节律性跳动的细胞团，且跳动细胞团数量在总细胞团数量中的比例明显提高。不管是EBs悬浮培养还是贴壁培养阶段加入心肌诱导液，都发现0.1 mmol/L Vc与5 µmol/L 5-aza联合处理组诱导效果最佳，发生节律性跳动的细胞团百分比达30%以上，这表明加入心肌诱导液的时间对心肌细胞的诱导分化效率没有显著影响。另外，0.1 mmol/L Vc与5 µmol/L 5-aza联合诱导组节律性跳动细胞团所占百分比明显高于 5 µmol/L 5-aza单独诱导组，两者之间差异极显著，说明Vc在 pAFS向心肌细胞诱导过程中起着非常重要的作用。从图3中还发现，0.1 mmol/L Vc与10 µmol/L 5-aza联合诱导组，跳动细胞团所占百分比，虽然显著高于对照组但是较0.1 mmol/L Vc与5 µmol/L 5-aza联合诱导组明显降低，表明5-aza的浓度也是影响 pAFS向心肌细胞分化的重要因素(图 3A、B)。同时统计每个诱导组细胞团持续跳动时间，发现除0.1 mmol/L Vc处理组细胞团持续跳动时间较短 (5 d左右) 外，其余各处理组的细胞团持续心肌样跳动时间都在9 d左右 (图3C、D)。比较不同时间段加入诱导剂对类胚体持续跳动时间的影响发现，0.1 mmol/L Vc处理组在EBs贴壁阶段加入诱导剂，细胞团持续跳动时间要比EBs悬浮阶段加入诱导剂组平均时间长3 d；相反，在10 µmol/L 5-aza处理组，EBs贴壁阶段加入诱导剂组要比EBs悬浮阶段加入诱导剂组，细胞团持续跳动时间短，方差分析差异显著 (P＜0.05)，而其余各处理组类胚体持续跳动时间差异不显著。

图1 猪羊水干细胞分离培养Fig. 1 Morphology of isolated pAFS. (A) pAFS cells in P1 (50×). (B) pAFS cells in P15 (50×).

图2 猪羊水干细胞通过类胚体诱导分化Fig. 2 pAFS cells form embryoid bodies and differentiate into cardiomyocyte like cells. (A) EBs cultured in suspension for seven days (50×). (B) EB cultured in adherent dish for 24 h (200×). (C) EB cultured in adherent dish for one week (200×) a lot of cells come out around EB. (D) New cell clones formed during the inducing process (4×).

图3 节律性跳动心肌细胞团的统计分析Fig. 3 Statistical analysis of beating cardiomyocyte-like cell clusters. (A,C) The inducing medium was added when EBs were cultured on the ultra-low attachment culture dishes. (B,D) The inducing medium was added when EBs were cultured on the adherent dishes. 0: ACM; 1: ACM+0.1 mmol/L Vc; 2: ACM+0.1 mmol/L Vc+10 µmol/L 5-aza; 3: ACM+10 µmol/L 5-aza; 4: ACM+0.1 mmol/L Vc+5 µmol/L 5-aza; 5: ACM+5 µmol/L 5-aza.

图4 猪羊水干细胞向心肌细胞诱导分化的免疫荧光检测和RT-PCR检测Fig. 4 Immunocytochemistry and RT-PCR analysis of induced cardiomyocyte derived from pAFS. (A) Cytoskeletal protein a-actin (200×). (B) Cardiac troponin Tnni3 (200×). (C) The expression of cardiomyocyte specific markers detected by RT-PCR.

2.3 免疫荧光、PCR检测结果

为检测诱导分化的跳动细胞团是否含有心肌细胞特异分子标记，对跳动细胞团进行了 α-actin和Tnni3蛋白免疫荧光标记测定，结果显示诱导 17 d后的细胞团呈现α-actin和Tnni3阳性 (图4A1、B1)，而诱导前的EBs呈阴性反应 (图4A2、B2)。从节律性跳动的细胞团中抽提总RNA，进行RT-PCR检测，结果发现节律性跳动的细胞团能够表达心肌细胞早期标记基因TbX5和Gata4，同时也能够表达控制心肌收缩舒张的基因α-MHC和Tnni3 (图4C)。这些结果证明pAFS经诱导可分化为心肌样细胞。

2.4 透射电镜检测结果

对节律性跳动的细胞团进行透射电镜观察，结果表明猪羊水干细胞诱导分化的跳动心肌细胞团含有组成肌纤维的肌丝、糖原粒、糖原池等结构 (图5A)。但是与正常猪心肌组织电镜照片比较，未见到组成肌纤维的Z线和肌小结等结构 (图5B)，说明本实验诱导得到的跳动细胞团还处于心肌发育的早期阶段。

3 讨论

有关胚胎干细胞和间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的研究已有报道，但是用羊水干细胞向心肌细胞诱导分化的报道还不多。2007年Chiavegato等报道人羊水细胞可以诱导分化为心肌细胞[13]，2009年有科学家报道将人羊水细胞来源的 iPS细胞诱导分化为心肌细胞[14]，而关于 pAFS向心肌细胞诱导分化的研究未见有报道。在向心肌细胞诱导分化的实验中多采用去甲基化药物，如胞嘧啶类似物 5-氮胞苷及其衍生物[15-17]。因为其可通过与细胞内甲基转移酶的共价结合，使部分甲基化沉默基因去甲基化，恢复表达活性，同时可修饰某些基因的表达或调节细胞分化[17-20]。目前，5-氮胞苷主要应用于诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究中[21]。亦有研究表明，人胚胎干细胞暴露于5-aza中可分化为心肌细胞[22-23]。

2009年有报道称维生素C能够促进胚胎干细胞向心肌细胞分化[12]。我们在研究中，利用5-氮胞苷为诱导剂的同时，也加入了维生素C诱导猪羊水干细胞向心肌细胞分化，旨在检测维生素 C在 pAFS向心肌细胞诱导分化的过程中是否也具有促进作用。同时我们比较了5-aza和Vc不同组合方式处理下，心肌样跳动EBs的百分比。在实验中我们发现，单独的维生素C或与5-aza的联合诱导均能够促使猪羊水干细胞形成类胚体，并最终形成节律性跳动细胞团。但各处理组跳动细胞团占细胞团总数的百分比不同，其中0.1 mmol/L Vc与5 µmol/L 5-aza联合诱导组类胚体跳动百分比达33%，显著高于对照组的5%。说明找到了pAFS向心肌细胞分化的一种有效方法，同时证明了维生素C在心肌细胞诱导分化过程中起着非常重要的作用。这一结果与王艳霞等的报道一致[12]。但是维生素C在心肌细胞诱导分化过程中的分子机理还需要进一步的研究。

图5 透射电镜检测Fig. 5 Transmission electron microscope analysis. (A) Experimental group (30 000×). (B) Positive control (50 000×).

TbX5、Gata4之间存在着复杂的相互作用，在心脏发育中起主要作用[24]，共同调控许多下游基因的表达。α-MHC为肌球蛋白重链，控制心肌收缩，在心肌细胞衰竭过程中转化为 β-MHC[25-26]。Tnni3为心肌肌钙蛋白，在肌肉收缩和舒张过程中起重要调节作用[26]。pAFS分化的节律性跳动细胞团在进行RT-PCR分析时，能够表达心肌细胞早期标记基因TbX5、Gata4；成年期占优势的心肌细胞特异性标记基因α-MHC、Tnni3。α-actin为细胞骨架蛋白，在心肌细胞中特异性表达[26-27]，实验中对 pAFS细胞分化而来的节律性收缩的类胚体进行免疫荧光染色，发现α-actin呈阳性表达。透射电子显微镜分析，诱导的节律性跳动细胞团只具有肌丝、糖原粒等结构而不具有Z线和肌小结等结构，说明贴壁诱导培养10 d的跳动细胞团还处于心肌发育的早期。对出现这一现象的解释可能是由于诱导分化时间还不够长。总之，在本研究中我们对 pAFS向心肌细胞的诱导分化做了初步探索，找到了 pAFS向心肌细胞分化的一种有效方法，加之 pAFS来源丰富，易于获取，有望成为较胚胎干细胞和间充质干细胞更为理想的替代细胞。因此，对 pAFS的分化调控以及参与诱导其向特定组织细胞分化的因子或信号分子需要进一步研究。

综上，本研究采用免疫荧光、RT-PCR、透射电子显微镜技术检测了pAFS在5-aza和Vc诱导条件下分化形成的节律性跳动细胞团，证明pAFS经诱导可以分化为心肌样细胞。统计分析显示 4# ACM+0.1 mmol/L Vc+5 µmol/L 5-aza联合诱导组的诱导效率最高达到33%。本研究提供了pAFS向心肌细胞分化的一种有效诱导方法。

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