肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展*

吴亚红，高艳锋，祁元明

郑州大学生物工程系郑州450001

(2011-07-05收稿 责任编辑 姜春霞)

恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要疾病之一，尽管手术治疗联合化疗/放疗能够延长患者的生存期，但是这些治疗手段也会损伤正常细胞，产生很多不良反应，再加上很多恶性肿瘤具有侵袭转移和复发等特征，因此，急需发展新的方法来治疗肿瘤患者［1］。随着人们对免疫系统及其调节方式的逐渐认识，肿瘤的免疫治疗已成为传统疗法的必要补充，由于其不良反应小，且能在机体内建立免疫记忆，因此引起了人们的广泛关注。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)介导的特异性细胞免疫在抗肿瘤免疫过程中发挥着主要作用。CTL不仅能通过颗粒酶和穿孔素等物质直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌一些细胞因子如IFN-γ和TNF-α等间接地杀伤肿瘤细胞［2］。T细胞特异性活化的第一步是其表面的 T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)与存在于肿瘤细胞或抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)表面的抗原肽-MHC(人类MHC称为HLA)复合物的特异性结合，即T细胞所识别的是肿瘤特异性抗原或相关抗原中能与相应的HLA分子槽状结合部位相匹配的称为抗原表位的小肽片段。因此，寻找能够激活肿瘤特异性CTL的抗原肽表位一直是该领域的研究热点和前沿课题。研究［3］表明，肿瘤细胞表面的抗原肽能够有效地诱导针对肿瘤细胞的免疫应答，且抗原肽为基础的疫苗具有一些独特的优势，比如结构和产物相对简单、化学性质稳定、安全性高、成本低和制备方便等，此外表位肽还可以通过修饰来提高免疫原性，包括形成多表位疫苗或引入非天然的氨基酸，因此抗原肽疫苗是肿瘤免疫治疗的理想候选。但是如何筛选更特异性的肿瘤抗原、提高抗原肽的免疫原性以及选择更好的佐剂及载体仍然是发展抗原肽疫苗亟待解决的问题。该文主要就CTL表位肽相关研究的策略和进展进行阐述。

1 肿瘤抗原

肿瘤抗原是对细胞癌变过程中出现的新抗原物质的总称。这些物质中的蛋白质被降解后产生的一些肽段能够与MHC分子结合，并提呈到细胞表面，成为CTL识别杀伤的靶点［4］。根据肿瘤抗原特异性的程度将肿瘤抗原分为两大类:一类是只存在于肿瘤细胞中而不存在于正常细胞中的肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen，TSA);另一类是在肿瘤细胞、正常组织及细胞中均存在，但在肿瘤时期含量明显增加的肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，TAA)。目前已经有2000种以上的肿瘤抗原被鉴定。

TSA主要包括:①癌睾抗原(cancer-testisantigen，CT 抗原)［5-6］:此类抗原只在睾丸、胚胎等免疫豁免器官和肿瘤组织中表达而在其他正常组织中不表达，因此，也被认为是肿瘤特异性共享抗原。目前已经有超过100个基因家族的CT抗原被鉴定出来，并建立了CT抗原数据库CTDatabase(http://www.cta.lncc.br/)，可以查阅目前为止发现的所有CT抗原的信息。一些针对CT抗原的治疗性癌症疫苗已经进入Ⅱ/Ⅲ期的临床试验，包括MAGE-A3和NY-ESO-1等，它们是肿瘤免疫治疗的理想靶点［7］。②基因突变产生的抗原:此类抗原也是一类潜在的肿瘤抗原，在患者和动物模型中这些突变都可能诱导产生针对肿瘤的特异性CTL，启动免疫应答。比如突变的 p53［8］、p21/ras和 β-catenin 等，以p53为靶点的肿瘤免疫治疗疫苗已经进入临床试验阶段。③病毒基因编码的抗原:人类一些恶性肿瘤与某些特定的病毒感染疾病相关，如人乳头瘤病毒(HPV)［8］和乙型肝炎病毒(HBV)等。此类抗原在相关的肿瘤组织中表达，可以作为预防型和治疗型疫苗的理想靶点。④剪切不同产生的抗原:如何杰金淋巴瘤组织中的 restin［9］。

大多数TAA只是表现在表达量的变化，没有严格的肿瘤特异性，最为常见的是过表达抗原。研究较多的有MelanA和HER-2/neu等［10］。

过去寻找肿瘤抗原最常用的是免疫学方法，如T细胞表位克隆技术和cDNA表达文库的血清学分析方法(SEREX)［11］。近几年发展起来了一些高通量的基因表达分析方法使得发现新肿瘤抗原的速度大大加快，如cDNA芯片分析、基因表达连续性分析和大规模平行信号测序等方法。

2 表位预测

肿瘤特异性免疫治疗的前提是寻找有效的CTL表位，而CTL表位的快速筛选和鉴定又是CTL表位疫苗研究的关键。传统的表位鉴定方法如利用酸性条件从肿瘤细胞表面洗脱和鉴定抗原肽及合成大量的重叠肽，然后进行表位鉴定，这些方法既费时又费力。自从基于“反向免疫学”理论的免疫信息学表位预测方法出现之后，对抗原表位进行预测成为表位鉴定的有效工具［12］，通过表位预测不仅能提高表位鉴定的效率，还能够减少合成和活性实验的工作量，节约研究经费。

当前CTL表位预测方法的发展很快，已经不仅仅局限于单纯的MHC分子和抗原肽亲和力的预测，很多软件也加入了蛋白酶体裂解位点预测、TAP转运效率预测和抗原肽空间结构预测等手段，且综合运用多种预测方法大大提高了预测的准确度。目前运用最多的预测软件有NetCTL软件、SYFPEITHI软件、BIMAS预测软件、IEDB预测软件和EpiJen软件等［13］。人们已经运用这些软件筛选鉴定了多种有作用的抗原表位。

近年来人们综合运用矩阵打分、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)等方法将表位预测的准确度进一步提高。相信随着蛋白质预测技术的不断创新，对CTL表位预测的准确度将大大提高。

3 表位鉴定

对抗原表位的预测能够实现对表位的初步筛选，然而，目前大多数软件的预测准确率不高，因此，对表位的鉴定必须依赖后续的一系列实验。通常包括以下步骤:①合成预测获得的表位肽，通过高效液相色谱(HPLC)或其他手段对表位肽进行分析纯化，通过质谱等手段对表位肽进行物化性质鉴定。②通过亲和力实验检测表位肽与MHC分子的亲和力及形成的MHC/肽复合物的稳定性［14］，筛选得到亲和力以及稳定性较高的表位直接进行后续的活性研究，对亲和力和(或)稳定性较低的表位可以进行结构改造获得表位肽类似物进行后续实验［15-16］。③检测待测表位在健康志愿者和肿瘤患者的外周血单个核细胞(PBMC)中诱导产生CTL的能力［17］，通常进行ELISPOT实验或者采用细胞内染色的方法检测CTL分泌细胞因子的能力，通过细胞毒性实验(如Cr51或LDH释放实验)检测诱导产生的CTL对肿瘤细胞的杀伤状况。④检测待测表位体内诱导产生CTL的能力以及获得的CTL对肿瘤细胞的杀伤状况。通常采用HHD转基因小鼠［18］或HLA-A2.1/Kb转基因小鼠模型［19］进行研究。⑤建立荷瘤模型［20］，检测体内外诱导产生的CTL对实体瘤的杀伤作用。通常会建立预防型肿瘤模型和治疗型肿瘤模型来研究抗原表位的作用。目前作者的研究组［21-22］也已经通过以上方案鉴定出一些具有明显抗肿瘤活性的抗原表位。

4 肿瘤抗原肽疫苗的研究进展

从1990年发现第一个TAA开始，抗原肽疫苗的概念就为癌症治疗提供了理想的模式，旨在诱导获得治疗性CD8+T细胞反应的合成肽疫苗经历了很长时间的狂热阶段，人们在抗原肽疫苗的设计、合成和转运方面做了很多的改进，也鉴定获得了相当数量的抗原肽疫苗。目前已经有多种抗原肽疫苗进入了临床试验，如来自于 HER-2/neu、MAGE-A3、MART-1、TRP-2、gp100 和 NY-ESO-1 等抗原的单个或混合表位肽疫苗均有较多的研究［23］。

尽管抗原肽疫苗在动物模型中取得了很好的效果，但是在临床上获得的效果却极其有限［24］。因为肿瘤抗原是自身抗原，会对机体的免疫系统产生耐受，因此自身抗原的免疫原性通常较低，所以就需要改善肿瘤抗原的免疫原性。目前常用的方法有:①改变抗原肽锚定位点的氨基酸残基来增强它们与MHC分子的亲和力，同样也能在不产生自身免疫的情况下增强抗肿瘤免疫反应，已经在一些动物模型［15］中得到了验证。②对MHC锚定位点以外的与TCR接触位点的氨基酸残基进行不规则的替换，所产生的表位能够更有效地刺激T细胞的活化，而且它们能够打破免疫耐受。③引入非天然氨基酸来改善与MHC的结合和对TCR的激活特性，增强体内作用的半衰期。④将表位肽环化来降低被蛋白酶降解的几率，延长半衰期和稳定性，改变构象增加与受体的结合和改善免疫活性。⑤延长表位肽疫苗的氨基酸序列，获得可能同时包含CTL表位和Th表位，或包含多个CTL表位的长肽［25］，不仅能够提高免疫原性，也能够提升免疫反应的强度。⑥通过分枝多肽的方法构建获得来源于一个或多个肿瘤抗原的小的CTL表位或Th表位的多表位疫苗［26］。

在诱导免疫的过程中，T细胞产生耐受的另外一方面是缺乏共刺激信号或危险信号。借助共刺激信号的帮助且刺激得当的话，APC尤其是树突状细胞(DC)能够被成功地激活，扩增并引导T细胞向肿瘤部位迁移。佐剂是一类能够增强抗原免疫原性的物质，目前已经在癌症疫苗中得到了应用，很多佐剂除了能够增强免疫刺激以外，也可以以“油包水”的状态作为疫苗的转运系统起作用。目前，一些新型的佐剂主要集中在增强体液免疫反应以及对模式识别受体和共刺激分子等的调节方面。此外，为了增加抗原肽疫苗在临床上成功的机会，精确地选择治疗的模式和时间点非常重要。

5 展望

尽管人们通过多种方法来改善肿瘤抗原肽疫苗的效果，但是到目前为止它们在临床患者中的抗肿瘤疗效还是比较有限的，通过对临床试验结果的分析，今后有可能在以下方面进行进一步的研究和改进:①鉴定那些参与肿瘤细胞增殖/存活的肿瘤抗原以及肿瘤干细胞中表达的肿瘤抗原，以它们为靶点有可能对抗肿瘤细胞的抗原下调和清除其中的肿瘤干细胞。②鉴定发现在多种肿瘤类型中均具有较高表达水平和抗原性的肿瘤抗原来诱导针对多种内源性肿瘤抗原的免疫反应。③改善APC对抗原加工和提呈的能力，包括使用佐剂。④通过多表位疫苗的构建，改善CTL和Th在体内扩增的能力。⑤了解癌症产生免疫抑制效应的机制，打破机体对肿瘤的免疫耐受状态，尤其是针对肿瘤微环境中的一些抑瘤信号途径、细胞因子和负性共刺激分子为靶点进行肿瘤免疫治疗。⑥在治疗的时机上，更好地与放化疗进行配合。此外，以预防为主的肿瘤抗原肽疫苗在诱导抗肿瘤反应中是极其有效的，可能具有更好的应用前景。随着抗原肽疫苗的不断改进，它必将会成为治疗肿瘤的一种重要手段。

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