变形链球菌LuxS蛋白与LuxS/AI-2群体感应系统的研究进展

夏 丽 储冰峰

变形链球菌是口腔致龋的主要细菌之一。变形链球菌能够选择性地在牙齿表面黏附，形成细菌生物膜，促进菌斑形成，通过摄入蔗糖、葡萄糖和果糖等进行糖酵解，产生能量同时生成大量乳酸，使牙齿硬组织脱钙致龋。LuxS蛋白酶在1999年被Winzer等人[1]证实存在，但早在上世纪60年代该蛋白酶就作为S-核苷高半胱氨酸(S-ribosylhom ocysteine,SRH)的裂解酶被报道[2]，是细菌转甲基作用和蛋氨酸循环合成途径之一的关键酶。近年来，有大量的研究报道了，LuxS作为自体诱导信号分子-2(autoinducer-2,AI-2)生物合成中不可或缺的酶。

口腔环境中存在大量细菌，细菌能够适应环境的变化是通过识别细胞外的信号，调控自身基因表达来实现的。这种胞外信号由细菌产生后，可以调控同种细菌数量，也可以被异种细菌识别，作为异种细菌间的交流信号，调节不同种属细菌的生物行为，这一现象被称为群体感应[3](quorum sensing,QS)。已在多种革兰氏阴性和阳性菌中证实并且在大量研究中发现AI-2可以介导不同种属间的细菌交流。在各种不同细菌中，LuxS的同系物参与AI-2的生物合成。AI-2介导的群体感应机制可以调节基因表达，包括生物膜形成、毒力因子、生物荧光、抗生素耐药性、形成孢子和形成感受态等。干扰这一系统会改变细菌的致病性，由于LuxS/AI-2在不同的细菌中调节这些行为，也使其成为药物抑制剂靶点。本文对变形链球菌中LuxS蛋白基因、结构、作用机制和功能，尤其是LuxS/AI-2群体感应的相关内容作一综述。

1.LuxS蛋白的基因特点

变形链球菌的LuxS是含160个氨基酸的金属蛋白酶，LuxS在细菌中有近50%的保守序列[4][5][6]。Wen等[7]通过对变形链球菌UA159全基因组的研究，发现与哈维氏弧菌同源的luxS基因。该基因位于染色体的nt443111到442632，由480个碱基对组成的开放阅读框编码。Merritt等[8]通过对变形链球菌基因进行BLAST研究，发现LuxS蛋白基因编码的氨基酸序列在革兰氏阳性菌有高度同源性，与化脓链球菌、肺炎链球菌、乳酸球菌、产气荚膜杆菌的LuxS蛋白分别有84%、83%、64%、45%的一致性和92%、91%、79%、64%的相似性；在革兰氏阴性菌也有显著的同源性，与哈维氏弧菌、脑膜炎奈瑟氏菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌的LuxS蛋白分别有38%、36%、37%、37%的一致性和57%、58%、59%、58%的相似性。说明LuxS蛋白的保守性较好，可能与其发挥重要的生理功能有关。

2.LuxS蛋白的结构

LuxS蛋白有HXXEH(His-Xaa-Xaa-Glu-His)保守序列，这种序列通常在含有Zn2+的蛋白中测得。LuxS的晶体结构既有游离的基团，又存在S-核苷高半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH)或高半胱氨酸，溶解度高[9]。LuxS存在同型二聚体，每个亚基的残基在二聚体表面有相同的活化位点，每个活化位点存在一个二价的金属离子，以前被认为是Zn2+，近年来Pei等[10]认为是Fe2+。在枯草杆菌中金属离子的4面分别与HXXEH保守序列的54位和58位组氨酸、126位半胱氨酸和水分子结合，这一结构为酶的催化中心。Fe2+活化氧分子，半胱氨酸被氧化为磺丙氨酸，蛋白结构改变，LuxS酶失活。LuxS金属蛋白酶的配基环境与多肽的去甲酰基酶相似，Fe2+形式的LuxS在有氧的环境下会迅速失活，而由Zn2+或Co2+组成的LuxS蛋白形式却非常稳定，Co-LuxS的催化能力与Fe-LuxS相同，比Zn-LuxS强10倍。

3.LuxS的作用机制

LuxS催化非氧化还原反应的硫醚键断裂[11]。Pei等[10]认为LuxS催化的反应是一种金属催化羰键转移的反应。在水溶液中，SRH的核糖环水合后以醛的形式处于平衡状态，形成酶-底物复合体。SRH的C1羰键打开与酶的金属离子结合，取代酶中金属离子结合的水分子或氧。随着金属离子的增多，SRH的C2碱基与酶的其他活化位点结合，形成五碳烯二醇化物，溶液中质子增加，与酶结合的C1羰键的氧再结合质子，形成含酮键的互变异构体中间产物，C2形成羰基，与酶的金属离子结合，C1羰键与酶断开。如此循环，最后进行β-消除，产生4，5-二羟基-2，3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione， DPD)，DPD再自发转化成酮式。

3.1 参与活化甲基代谢 LuxS在细胞甲基代谢中有重要作用，为细胞的RNA、DNA、特殊的代谢和蛋白提供甲基，是中间产物S-腺苷高半胱氨酸(S adenosylhomocysteine,SAH)循环的关键酶之一。LuxS活化甲基代谢的反应，有与催化形成AI-2相同的途径，从S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)生成高半胱氨酸；也可由另一条途径，经SAH水解酶，直接将SAH催化生成高半胱氨酸，这一途径不产生AI-2。高半胱氨酸在钴胺素依赖的甲硫氨酸合成酶作用下生成甲硫氨酸，甲硫氨酸经SAM合成酶催化形成SAM，完成转甲基作用和蛋氨酸循环。

3.2 催化形成AI-2 AI-2由SAM经过至少3步酶促反应生成，SAM在甲基转运酶催化下与甲基供体反应，生成毒性中间产物SAH，SAH与SAM结构相似，是一个潜在的SAM依赖的甲基转移酶的反馈抑制剂，SAH很快被S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase，Pfs)分解，生成腺嘌呤和 SRH，SRH由LuxS催化部分核糖基断裂，形成烯醇形式的DPD和高半胱氨酸[12]，DPD自动重排形成AI-2。研究[13]证实通过等位基因替换技术构建的变形链球菌luxS缺陷株不能产生活性AI-2。

4.变形链球菌的LuxS和LuxS/AI-2群体感应系统的作用

由于LuxS蛋白在细菌甲基代谢和AI-2合成中发挥重要作用，Merritt等[8]利用AI-2特异性报告菌株V.harveyi BB170证实，变形链球菌可产生功能性的AI-2，且在对数生长的中晚期达到最高值。已有研究证实LuxS与变形链球菌的生物膜形成、糖代谢、产酸耐酸、变链素等毒力因子密切相关。

luxS缺失突变的变形链球菌菌株的生物膜形成能力与培养条件相关。Wen等[7]建立luxS变异的变形链球菌UA159，在96孔板上培养，对生物膜形成没有影响。Merritt等[8]则观察到luxS缺陷株形成的生物膜结构改变，表面粗糙，更易凝结成块，对清洁剂和抗生素耐药性增强。生物膜形成的变化与培养细菌的环境有关。在蔗糖介质中变化明显，luxS变异菌株生物膜松散呈巢穴状，而野生株光滑平展。Yoshida等[14]建立luxS变异的变形链球菌GS-5，在0.5%蔗糖溶液中，变异株与野生株相比，生物膜明显变稀薄，电子显微镜扫描显示细菌凝聚团块变大。结果发现AI-2调节了葡萄糖转移酶基因，进而调控蔗糖依赖的生物膜形成。也有学者[15]用含蔗糖和葡萄糖的培养基培养luxS缺失的变形链球菌UA159，观察到在含蔗糖的培养基中luxS缺失菌株生物膜形成能力明显减弱，证实LuxS/AI-2主要对蔗糖依赖的生物膜形成起调控作用。

LuxS和LuxS/AI-2群体感应系统也参与了变形链球菌糖代谢、产酸耐酸及一些应激反应的基因调控。Yoshida等[14]建立luxS变异的变形链球菌，在0.5%蔗糖溶液中，变异株在对数生长中期，葡聚糖转移酶的gtfB和gtfC基因表达上调，而gtfD基因略下调。Wen等[16]通过luxS缺陷株发现关键的毒力因子果聚糖酶下调了50%以上，菌株对酸更加敏感，但仍有一定的耐受性。Northern杂交显示与DNA损伤修复相关的RecA，SmnA(AP核酸内切酶)，和Nth(核酸内切酶)都下调，尤其在对数生长的早期，其他下调的基因还包括编码膜相关蛋白的基因，如ffh(一个信号识别分子的亚单位)和brpA(生物膜调节蛋白A)，但对过氧化氢的耐受力增强。luxS基因缺失后，影响糖代谢和细胞膜结构的相关基因，luxS可能对细菌在酸性环境等一些应激环境下的耐受性有一定调节作用。

变链素是变形链球菌合成分泌的抗菌性多肽，在牙菌斑菌落中抑制其他细菌使变形链球菌生存，根据其产生菌株的不同分为变链素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在细菌密度高时，变链素Ⅰ的表达水平升高。研究表明[17][18]，luxS基因缺失导致变链素Ⅰ特异性结构调节子mutA和转录激活子mutR转录水平降低。此外，变形链球菌luxS突变株中irvA(变链素I抑制子)的转录水平显著提高，同时缺失luxS和irvA基因，变链素合成水平恢复。说明当LuxS蛋白功能正常时irvA转录受到抑制，当luxS基因缺失时irvA基因表达量大幅提高。高水平的irvA抑制mutA和mutR转录，进一步导致变链素I合成水平降低。正常情况下，随着细菌密度增加，变形链球菌分泌的AI-2达到一定浓度时，irvA的转录受到抑制，变链素I表达升高；当luxS缺失时，irvA的表达增加，mutA和mutR转录受到抑制，变链素I表达降低。但luxS、irvA、mutR、mutA和变链素I具体的相互作用机制还有待进一步研究。

LuxS和LuxS/AI-2系统在变形链球菌的生理活动中发挥了重要作用，但究竟是LuxS蛋白在细菌转甲基和蛋氨酸循环中所起的作用，还是LuxS/AI-2群体感应机制引起的变化，还有待进一步验证。Hasona等[19]用基因芯片分析LuxS蛋白表达下降的变形链球菌，发现包括分子伴侣、蛋白酶、细胞被膜合成酶、DNA修复和复制酶的81个蛋白基因表达上调，而与细胞感受态相关的基因、核糖体蛋白、与氨基酸和蛋白的生物合成酶有关的35个基因表达下调。Sztajer等[20]将LuxS的代谢功能与AI-2信号分子的功能分离研究，培养luxS缺失的变形链球菌UA159，并加入化学合成的DPD，发现585个基因表达受影响(占基因组的30%)，这种变化不能由信号分子AI-2恢复，因此不是受群体感应的影响，而是由于LuxS酶不能在甲基转运代谢的过程中发挥作用所致。细菌中几乎所有功能酶都受到影响，包括与生物膜形成、杆菌素合成、感受态和耐酸性相关的酶。同时，有59个基因在添加AI-2后转录改变，这些基因与蛋白合成、细胞张力、分裂有关。其中有3个与已知的AI-2转运蛋白无关的膜转运蛋白表达增加。因此luxS缺失会直接导致细菌的基因和表型变化，LuxS蛋白对细菌的基因表达和细菌多种蛋白的功能有直接调节作用。而LuxS催化形成AI-2信号分子，通过LuxS/AI-2群体感应系统调节细菌生物膜中细菌的生物学行为，也能够有效地促使细菌检测种群的密度变化，并通过改变细菌的状态来调整群体细菌的种类和密度。

5.问题与展望

变形链球菌LuxS蛋白调控变形链球菌基因表达，并催化形成AI-2信号分子，是群体感应效应中的关键蛋白。LuxS/AI-2信号系统在调控细菌生物膜形成、糖代谢、耐酸性、耐药性等方面有重要作用。近年来防龋研究主要集中于以PAc，GTFs和GBPs为疫苗靶点的抗龋疫苗研究[21]，尽管目前对LuxS蛋白具体的调控机制和LuxS/AI-2信号系统的传导途径还不明确，但不管是针对LuxS蛋白还是LuxS/AI-2信号系统的研究，都可以使我们进一步认识口腔细菌生存的生理机制，并且成为口腔致龋菌药物治疗的新靶点、新途径。

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