磷酸肌酸对脓毒症大鼠心肌能量代谢的影响

李玮 肖雄箭 林建东

临床上，不管是在成人、儿童或新生儿中，脓毒症是导致死亡的常见因素，其复杂的发病过程和病理生理变化，可能和机体免疫、代谢失调、心血管系统功能紊乱有关[1-2]。在脓毒症所致的难治性低血压和多器官功能不全中，有10％～20％的患者存在严重的心肌功能障碍，其机制可能和心肌缺血、缺氧、炎症介质释放等有关。心功能障碍时心肌细胞的生理改变为能量供给之间的失衡，表现为以高能磷酸盐含量减少为特征的能量不足。本研究应用盲肠穿孔法复制大鼠脓毒症模型，通过观察磷酸肌酸钠对心肌细胞葡萄糖6-磷酸酶活性及心肌腺苷酸水平的影响，结合心肌超微结构改变，探讨磷酸肌酸钠对脓毒症心功能障碍的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备 健康SD大鼠30只（上海斯莱克实验动物有限公司提供），体重200～250g，雌雄不限，随机分为3组：（1）假手术组（A组，n=10），不进行盲肠结扎穿孔术,于假手术前1h腹腔注射1m l的生理盐水；（2）脓毒症组（B组，n=10），于盲肠结扎穿孔术前1h注射1m l的生理盐水；（3）磷酸肌酸钠组（C组，n=10），于盲肠结扎穿孔术前1h腹腔注射磷酸肌酸钠100mg/kg（1m l）。

假手术组动物只开腹、关腹与复苏，不结扎、不穿孔盲肠。盲肠结扎穿孔术（caecum ligation per foration，CLP）制备ALI动物模型参考文献[3]，术毕立即皮下注射50m l/kg林格氏液抗休克。实验结束后，剖开胸腔，暴露心脏，快速取两块心肌组织（各约1cm3和1mm3），用于检测葡萄糖6-磷酸酶的活性及透射电镜观察。同时用液氮保存的铝夹在心脏原位冰冻，取组织100m g，置于液氮中低温保存，高效液相色谱法检测腺苷酸水平。

1.2 葡萄糖6-磷酸酶活性的半定量检测 取1cm3组织块于2.5％戊二醛溶液与二甲砷酸缓冲液中固定3h，按要求制备切片待检，用日产LUZEX-F分析仪镜检及半定量分析，根据细胞内茶褐色硫化铅沉淀分布的总面积大小进行半定量检测葡萄糖6-磷酸酶的活性。

1.3 ATP、ADP和AMP含量测定 高效液相色谱仪由美国Waters公司生产，ATP、ADP和AMP标准品由美国Sigma公司提供。预柱为Nova.pakC18，色谱柱为Nova-pakC 18（3.9mm×150mm），按要求专人正确操作。将ATP、ADP和AM P标准品分别配制成0.01mmol/L，0.02mmo1/L，0.0625mmol/L和0.125mmol/L的标准液，取20μl进样，得出标准曲线。使标准品浓度与峰面积呈良好的线性关系。将样品ATP、ADP和AMP获得的峰面积与标准峰面积相比，计算出样品ATP、ADP和AMP的含量。

1.4 心肌细胞透射电镜检查 取1mm3心肌组织块常规固化，用醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，超薄切片，在日立Hu-12A型透射电镜下观察。

表1 各组大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量测定值±s，n=10）

表1 各组大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量测定值±s，n=10）

注：*与假手术组比较P＜0.01；△与脓毒症组比较P＜0.01

组别 G-6-PD（％） ATP（μmol/g） ADP（μmol/g） AMP（μmol/g）假手术组（A组） 2.51±0.85 2.69±0.81 4.18±0.49 4.85±0.61脓毒症组（B组） 1.24±1.42* 1.36±0.40* 2.23±0.35* 3.14±0.52*磷酸肌酸组（C组） 1.90±0.54△ 2.01±0.42△ 3.96±0.50△ 5.06±0.72△

2 结果

2.1 葡萄糖6-磷酸酶的组织化学检测 脓毒症组与假手术组比较，葡萄糖6-磷酸酶活性明显降低，而经磷酸肌酸处理后则明显升高（P＜0.01）,见表1。

2.2 心肌ATP、ADP和AM P含量测定 脓毒症组的心肌ATP、ADP和AMP含量明显低于假手术组（P均＜0.01），经磷酸肌酸处理后含量明显升高（P均＜0.01），见表1。

2.3 心肌细胞透射电镜检查 电镜下见假手术组心肌细胞结构正常，线粒体无肿胀，嵴排列整齐，心肌纤维排列规则。脓毒症组线粒体减少，肿胀变形，外膜不清，空泡化，核糖体脱颗粒，嵴减少或消失，排列紊乱。肌丝、股节结构断裂缺失，核膜破裂，细胞基质稀少。磷酸肌酸组病变较脓毒症组减轻，线粒体肿胀较轻，膜尚完整，嵴略稀疏，部分线粒体破坏，排列仍规则，肌丝结构排列尚规则。

3 讨论

在临床上，心肌细胞损伤及功能障碍是脓毒症常见的并发症，心功能障碍又会加剧脓毒症病情且是影响脓毒症预后的重要因素[4]。心肌细胞能量代谢障碍在心功能障碍和心肌细胞结构重建中发挥重要作用。能量的生成分为有氧氧化和无氧酵解，有氧氧化要在线粒体中完成，而无氧酵解主要在胞浆中进行。有氧氧化反应过程是从胞浆进入线粒体才完成的，葡萄糖6-磷酸酶是糖异生反应的限速酶之一，它存在于胞浆中，该酶活性反映了糖异生变化。ATP是维持心肌细胞泵血功能必需的物质，因为在心脏组织中储存的ATP远远不能满足心肌细胞收缩和舒张之需要，所以，心肌细胞心须不断合成ATP以保持心肌细胞的有效功能。研究证实，在内毒素注射后1h[5]，大鼠心肌细胞G-6-PD活性增强，提示糖异生反应增强；注射后3小时，该酶的活性明显下降，提示糖异生减弱。脓毒症早期，机体处于高代谢状态，组织细胞需氧量增多，而实际上因为存在微循环障碍及组织利用氧障碍等因素，组织获取氧量减少。因此，组织通过有氧氧化而生成的ATP减少。机体为了增加ATP的生成，必然增强无氧酵解。本实验中，因脓毒症引起心肌细胞超微结构的变化，线粒体肿胀、破坏，有氧氧化减弱，ATP、ADP和AM P生成减少。随着能量物质及其底物的消耗和线粒体功能结构的改变，胞浆中酶的含量和活性也发生了变化，G-6-PD活性下降，糖异生减弱，更进一步加快能量耗竭。

在心脏组织中，磷酸肌酸（Creatine Phosphate,CP）是最主要的能量合成底物，可生成细胞代谢所需的能源物质—三磷酸腺苷（ATP），并在线粒体到细胞质的能量运输与分配中起着重要的作用。心肌损伤时所消耗的ATP要靠CP转化来补充，所以，损伤时CP也同样大量消耗，而心肌细胞本身储备的CP是有限的，此时提供外源性CP参与损伤心肌的能量供应，可以解决损伤心肌最根本的能量代谢问题。外源性高能磷酸肌酸盐已被普遍认为在体外循环手术中对心肌缺血有良好的保护作用，主要用于动物实验和冠状动脉搭桥手术病人[6-7]。本研究应用外源性磷酸肌酸治疗脓毒症大鼠，证实其能改善脓毒症心肌能量代谢障碍和心肌的超微结构。

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