EAE大鼠临床病变与胸腺损伤关系探讨①

袁宏宇 董 梅 刘瑞春 郭 力 郭艳苏 吴东霞 陈丽萍

（河北医科大学第二医院神经内科,石家庄 050000）

EAE大鼠临床病变与胸腺损伤关系探讨①

袁宏宇 董 梅 刘瑞春 郭 力 郭艳苏 吴东霞 陈丽萍

（河北医科大学第二医院神经内科,石家庄 050000）

目的:研究EAE大鼠发病后不同时期临床病变与胸腺损伤之间关系。方法:观察正常及EAE发病后3天、5天及恢复期大鼠临床神经功能状态,测量各组大鼠体重、胸腺重量、计算胸腺指数,光镜下观察脑组织及胸腺病理变化,采用流式细胞术检测各组胸腺细胞凋亡率。结果:发病3天及5天大鼠肢体瘫痪,神经功能评分分别为2.60±1.22和1.50±0.512,两组之间无统计学差异。光镜HE染色显示发病3天胸腺显著萎缩,淋巴细胞数减少,发病5天较3天细胞数量有所恢复,恢复期组细胞数明显增多;发病3天脑组织大量炎细胞浸润,发病5天有多数袖套样改变,血管周围围绕较多炎细胞,恢复期炎细胞明显减少。发病3天组胸腺指数较其他组明显下降（P＜0.05）,其余组胸腺指数相比无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞术显示发病3天大鼠胸腺细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,其他组相比无统计学意义（P＞0.05）。结论:发病3天大鼠临床神经功能评分及胸腺损伤均较严重,大量胸腺细胞凋亡。随病情发展,胸腺呈现先萎缩、后恢复的动态过程,早于临床症状的恢复,说明胸腺具有自我恢复性,可以促使疾病缓解,可能参与EAE的发病过程。

实验性变态反应性脑脊髓炎;临床病变;胸腺;凋亡;病理

多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病,主要由CD4+T细胞介导,其病因和发病机制尚未阐明。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimentalallergic encephalomyelitis,EAE）是MS公认的动物模型,MS许多方面的进展是通过对EAE的研究实现的。胸腺是重要的中枢免疫器官,是CD4+T细胞的发源地。胸腺T细胞通过凋亡途径去除无自身免疫耐受的细胞,以维持机体的稳定。研究表明胸腺与MS有较大关系:去除胸腺的EAE小鼠失去了病情自然恢复能力,而存在胸腺的EAE小鼠病情可以缓解[1]。

本研究通过建立EAE模型,采用组织病理学、流式细胞技术、电镜等实验方法观察EAE大鼠不同发病时期胸腺的形态学、凋亡变化规律、及与大鼠神经功能障碍、脑组织病理学改变之间的关系,探讨胸腺损伤与EAE大鼠临床病变发生发展的关系及可能的作用,为进一步的实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立及分组 从河北医科大学实验动物中心选购约6～8周龄Wistar大鼠 70只[SCXK（冀）2003212003],雌性,体重 180～200克。用新鲜豚鼠的全脊髓制成匀浆加上完全弗氏佐剂（CFA）,佐剂中所含卡介苗量为6mg/m l,乳化后按0.5m l/只分别于大鼠四足垫内及背部皮下注射,免疫动物[2]。实验动物分四组,正常组、发病3天组、发病5天组、恢复期组,每组12～15只。

1.2 神经功能评分 所有实验动物自免疫当日起观察大鼠的精神状态、反应是否灵敏,进食水情况,大小便情况、尾部与肢体力量情况等。参照Kono[3]提出的标准,将发病程度分为5级:Ⅰ级动物尾部无力;Ⅱ级尾部无力+肢体无力;Ⅲ级肢体轻度麻痹;Ⅳ级肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;Ⅴ级濒死状态,选取发病程度Ⅱ级及其以上,按实验设计取材。

1.3 标本采集 动物称重后麻醉并打开胸腔,充分暴露出上端胸骨下呈白色的胸腺,从根部将胸腺完整摘下,称重,将胸腺分别固定于4%中性甲醛或4%戊二醛中,进行光镜、电镜检查;同时取脑组织固定于4%多聚甲醛中,进行光镜检查,以HE染色评估炎症病变。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料的数据用±s表示,神经功能评分采用Mann-Whitney U检验;胸腺指数,凋亡率多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q检验。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 临床表现及神经功能评分 EAE模型组的大鼠免疫后出现精神萎靡、食欲减退、皮毛不光滑、体重下降,于免疫后第16.30±4.10天发病,出现尾部张力降低、尾部无力,继之出现后肢、四肢无力、麻痹,大小便失禁,少数表现为仅双前肢的无力或瘫痪,无因病情危重而死亡。临床症状评分第3天组与第5天组比较无统计学意义（见表1）。

2.2 组织病理 正常组大鼠神经组织病理学未见异常,发病3天大鼠脑实质内有大量炎细胞浸润,弥散分布,部分锥体细胞形态略变圆顿,发病5天大鼠脑组织内可见多数“血管袖套”结构,周围有明显的炎细胞围绕,恢复期大鼠脑组织可见少数散在血管袖套,周围少量炎细胞浸润,不同发病时期病理改变与其临床瘫痪程度一致,符合临床特点（见图1）。

2.3 胸腺指数 即大鼠胸腺质量/大鼠体质量,第三天组大鼠胸腺指数有显著升高（P＜0.05）,其余各大组鼠胸腺指数与正常组相比无统计学意义（P＞0.05）,（见表2）。

表1 各组大鼠神经功能评分Tab.1 Nervous functional score of different groups

图1 不同时期EAE大鼠HE染色显示炎症改变（HE,×100）Fig.1 Inflammatory changes in brain of normaland EAE rats（HE,×100）

2.4 胸腺光镜结构 正常组大鼠胸腺结构正常,皮髓质分界清楚,皮质部染色较深的淋巴细胞密集,核呈蓝紫色,髓质部染色浅的上皮网状细胞较多,EAE各组大鼠胸腺细胞结构都发生不同程度的改变,淋巴细胞和上皮网状细胞均遭到破坏,第三天组呈现显著的胸腺萎缩,皮质明显变薄,淋巴细胞数减少,细胞松散,凋亡细胞数增多,核染色质浓缩,核固缩。而第五天组与第三天组比较凋亡细胞明显减少,第三天组和恢复组比较有明显差异（见图2）。

2.5 流式细胞术检测 结果显示各组细胞凋亡率,第3天组大鼠胸腺细胞凋亡率有显著升高（P＜0.05）,其余两组胸腺细胞凋亡率相比无统计学意义（P＞0.05,见表3）。

表2 各组胸腺指数Tab.2 Thymus index of each group

图2 各组胸腺结构（HE染色,×400）Fig.2 Thymus structure of EAE（HE,×400）

表3 胸腺细胞凋亡率Tab.3 Apoptosis rate of thymus cells

3 讨论

MS是以CD4+T细胞介导为主的自身免疫性疾病,基本病理改变为白质炎性脱髓鞘、轴索损伤、胶质细胞增生等,好发于年轻女性,大多数患者表现为反复发作的神经功能障碍,严重者可以致残,病因和发病机制尚未阐明。

胸腺是重要的中枢免疫器官,是T细胞分化成熟的场所,胸腺细胞经过阳性选择和阴性选择分化发育成少量只表达CD4+或CD8+的单阳细胞,即成熟T细胞,使自身具有MHC限制性和自身免疫耐受性,从胸腺迁出后移居到血液和周围淋巴器官中,发挥免疫调节作用。而大量未成熟T细胞则在分化中通过凋亡机制被清除,胸腺细胞整个发育过程自始至终受到细胞凋亡机制的监控,如果该机制出现紊乱,则将导致自身免疫病发生。因此,对胸腺形态改变及细胞凋亡的研究能体现胸腺的功能状态。MS的发病机制尚不清楚,发生在免疫器官内的反应尚未可知。MS患者MHCⅡ型限制性由来自胸腺、外周和脑部的抗原呈递细胞（APC）决定[4]。有关MS患者胸腺结构和功能变化的研究及对MS发病机制及神经功能障碍影响的报道逐渐增多,其作用仍有待于进一步研究。

胸腺对各种刺激非常敏感,应激反应、激素、药物及各种疾病均可致其迅速退化而发生病理改变[5]。一些学者研究发现在MS和EAE发病过程中涉及胸腺结构和功能的改变,并可能对疾病的发生和发展产生一定的影响。胸腺中持续的初始T细胞输出是保证循环中自身反应性T细胞受控制的必要条件。Duszczyszyn[6]观察了初始T细胞在RRMS患者体内的动态平衡,表明患者早期既有胸腺受累,伴有相应的外周T细胞增殖反应的代偿性自稳状态破坏,使患者容易发生自身免疫性疾病。Cavallotti[7]观察大鼠EAE胸腺的超微结构,显示了许多与EAE发病机理相关的变化,如胞浆内空泡增多,线粒体、粗面内质网等变化及细胞凋亡和坏死的增加。由此表明MS患者胸腺结构和输出T细胞功能均下降,可能会对疾病产生一定作用。Tsunoda等[8]研究发现,在SW小鼠RR-EAE中有胸腺萎缩,T、B细胞缺失和大量凋亡。Zimecki等[9]研究发现给EAE大鼠肌肉内注射胸腺提取物（TFX○R）及其六肽片段可以明显减轻临床表现、免疫学、病理学和超微结构改变,提示TFX○R及其来源的片段对神经变性疾病如MS有潜在的治疗作用。CD4+CD25+Foxp3（+）T调节性T细胞（Treg）的显著特征是对具有免疫活性的自身反应性T细胞具有抑制作用。研究表明胸腺在口服免疫耐受中具有诱导产生Treg、清除自身免疫性T细胞和输送初始T细胞的作用[10]。除来自胸腺的Treg细胞,外周来源的Treg在维持免疫平衡中也有重要作用,提示T细胞疫苗接种在MS和风湿性关节炎中具有治疗前景[11]。Anderton[12]发现缺乏LFA-1（-/-）的小鼠发生EAE加重,可能是与胸腺中Treg产生的数量的减少、对自身抗原免疫反应的放大和T细胞对CNS的浸润所致。Chen等[1]研究表明EAE发病后胸腺处于一种激活状态,通过增加胸腺间质细胞中IL-7的表达,加速胸腺细胞中Treg细胞的分化和增殖,使输出的Treg细胞增加,这个过程可以抑制疾病的进展并促进功能的恢复,提示胸腺在EAE中有自我调节的功能。Broux[13]最近研究发现自身稳定T细胞受体即IL-7R的基因型与MS相关。IL-7R多态性能影响胸腺中T细胞的发育和自稳平衡,导致与MS患者疾病进展一致的免疫调节的改变。Korporal[14]研究表明 IFN-β治疗MS可以上调Treg细胞的抑制功能,与增加胸腺来源的初始T细胞和降低记忆T细胞一致,达到维持Treg细胞的自稳平衡状态。

本实验动态研究了不同发病时期EAE大鼠临床神经功能障碍、脑组织及胸腺病理学改变、胸腺指数、胸腺细胞凋亡等,探讨胸腺损伤与临床病变之间发生发展的关系,作为研究胸腺在EAE发病中的作用及可能的机制的基础。胸腺指数在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱,当胸腺萎缩后培育T淋巴细胞成熟的内分泌微环境遭到破坏,我们发现在EAE发病早期即发病3天时胸腺就发生严重病变,胸腺明显萎缩变小、胸腺指数下降和大量胸腺细胞凋亡,表明胸腺结构和功能均受损伤,与大鼠严重的临床表现和较高的神经功能评分一致;但胸腺有很强的自我恢复能力,发病5天时胸腺迅速恢复形态,凋亡细胞也相应减少,与发病3天的检测结果差异具有统计学意义,而此时临床表现及神经功能评分均改变不明显,与发病3天时临床指标比较无统计学意义;恢复期胸腺形态及细胞凋亡水平接近正常,临床表现也恢复正常。本实验表明免疫原在诱发EAE的同时损伤了胸腺,随病情的发生发展胸腺萎缩,细胞凋亡增多,可能导致免疫耐受异常,加重疾病;在疾病恢复之前胸腺结构和功能先恢复,早于临床表现及脑组织病理学改变。凋亡的胸腺细胞呈先降低后恢复的动态改变,说明胸腺具有自我恢复性,可以促使疾病缓解,胸腺可能参与EAE的发病过程,与EAE发病有明显关系,其机制还需进一步研究。

1 Chen X,Fang L,Song SLetal.Thymic regulation ofautoimmune disease by accelerated differentiation of Foxp3+regulatory T cells through IL-7 signaling pathway[J].J Immunol,2009;183（10）:6135-6161.

2 Dong M,Liu RC,Guo Letal.Pathological findings in ratswith experimentalallergic encephalomyelitis[J].APMIS,2008;116（11）:972-984.

3 Kono D H,U rban J L,Horvath S Jetal.Two minor determ inants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/Jmice[J].JExp Med,1988;168:213-227.

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5 Ueno S,Kashimoto T,Susa Netal.Reduction in peripheral lymphocytes and thymus atrophy induced by organotin compounds in vivo[J].JVet Med Sci,2009;71（8）:1041-1048.

6 Duszczyszyn D A,Williams J L,Mason Hetal.Thym ic involution and proliferative T-cell responses inmultiple sclerosis[J].JNeuroimmunol,2010;221（1-2）:73-80.

7 Cavallotti D,D'Andrea V,Pastore FSetal.Pathogenesisofsome neurological immuneultrastructuralandmorphometricalobservationson rat thymus[J].Neurol Res,2005;27（1）:41-46.

8 Tsunoda I,Libbey JE,Kuang L Qetal.Massive apoptosis in lymphoid organs in animalmodels for primary and secondary progressivemultiple sclerosis[J].Am JPathol,2005;167（6）:1631-1646.

9 ZimeckiM,A rtym J,Kocieba Metal.Calf thymus extract attenuates severity of experimental encephalomyelitis in Lewis rats[J].Folia Neuropathol,2010;48（4）:246-257.

10 Song F,Guan Z,Gienapp IEetal.The thymus playsa role in oral tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006;177（3）:1500-1509.

11 Thümm ler K,Ramming A,Schulze-Koops Hetal.Cellular therapy in autoimmune disease[J].Z Rheumatol,2009;68（4）:337-339.

12 Anderton SM.Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation:a delicate balance,easily disturbed[J].Eur J Immunol,2010;40（12）:3321-3324.

13 Broux B,HellingsN,Venken Ketal.Haplotype 4 of themultiple sc lerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thym ic emigrants[J].Genes Immun,2010;11（4）:326-333.

14 KorporalM,Haas J,BalintBetal.Interferon beta-induced restoration of regulatory T-cell function inmultiple sclerosis ispromptedby an increase in newly generated naive regulatory T cells[J].Arch Neurol,2008;65（11）:1434-1439.

[收稿2010-08-10 修回2011-01-25]

（编辑 倪 鹏）

Study the relationship of clinical disease and the injury of thymus in EAE rat

YUANHong-Yu,DONGMei,LIURui-Chun,GUOLi,GUOYan-Su,WUDong-Xia,CHENLi-Ping.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective:To study the relationships between clinical diseaseand injury of thymus in different stageof experimental allergic encephalomyelitis（EAE）.Methods:Observing clinical nervous functional scores of different groupswer observed,aftermeasuring the body weights of rats,the thymuswere taken outandweighted it,thenweaccounted the thymus index.Weobserved the brain and thymus in lightm icroscopy to compare the changes in differentgroups.The apoptotic cells of thymusweremeasured by flow cytometry in different groups.Results:EAE ratwere paralyzed at different levelboth in the third day group and the fifth day group,the clinical scoreswere 2.60±1.22 and 1.50±0.512 respectively and they had no statistical significance.Significantatrophy and the numbers of lymphocytes of thymuswere seen in the third day group in lightmicroscopy.The lymphocytes increased in the fifth day group but theywere still lower than in the recovery group.There were increased lymphocytes and tight structure in recovery group.A lot of inflammatory cellswere seen in brain in the third day group;many perivascular cuffingswere in tissuesand they wereenclosed by inflammatory cells in fifth day group;therewereobviously diseased inflammatory cells in recovery group.Thymus indexwas lower in the third day group than in other groups（P＜0.05）and therewere no statistical significance in other threegroups.The apoptotic rateof thymus cellswas higher in the third day group than in other threegroups（P＜0.05）,there wereno statistically significant in other threegroups（P＞0.05）.Conclusion:The rat thymuses of EAEwere atrophy first and got improved.The recovery of thymuswas earlier than clinical symptomswhich showed that the thymuswere recoverable.The thymusmay participate in the course of EAE.

Experimental allergic encephalomyelitis;Clinical disease;Thymus;Apoptosis;Pathology

R744.5

A

1000-484X（2011）05-0459-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.018

①本文受河北省科技厅资助项目（No.08276101D-2）

袁宏宇（1984年-）,男,硕士,主要从事脱髓鞘疾病研究;

及指导教师:董 梅（1969年-）,女,博士,副主任医师,主要从事脱髓鞘疾病研究。