Pristane诱导狼疮鼠模型

王卓龙 李梦涛 曾小峰 （中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科,北京 100032）

Pristane诱导狼疮鼠模型

王卓龙 李梦涛 曾小峰 （中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科,北京 100032）

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及全身多系统器官组织的自身免疫性疾病,血清中存在以抗核抗体、抗dsDNA抗体为代表的多种自身抗体,目前病因、发病机理尚不完全清楚。合适的动物模型有助于对其进行研究。SLE动物模型分为自发性模型和诱导性模型。自发性狼疮小鼠要求小鼠严格传代,侧重研究遗传因素对SLE发病的影响。诱导性狼疮小鼠模型是指应用诱导剂使小鼠出现类似人类SLE病变表现的动物模型,主要用于研究环境因素对SLE发病的影响。

Pristane化学名是2,6,10,14-四甲基十五烷（2,6,10,14-tetramethylpentadecane,TMPD）。自从SatohM等1995年发现给非自发性免疫鼠BALB/c ByJ鼠一次性腹腔注射Pristane 0.5m l可成功诱导小鼠狼疮以来,该方法已成为诱导狼疮小鼠模型最常用方法[1,2]。本文就Pristane诱导狼疮小鼠模型综述如下。

1 Pristane诱导小鼠狼疮模型表现

包括免疫复合物型肾炎、关节炎、血管炎、血清中多种自身抗体等[2-4]。

肾小球肾炎 经Pristane诱导后大多数BALB/c鼠、SJL/J鼠均出现蛋白尿,严重程度不等,1+～4+。在注射Pristane后6个月的肾脏病理检查见免疫复合物型肾小球肾炎,光镜下表现为节段性或弥漫性增殖性肾小球肾炎,可见轻、中度单核细胞侵润,系膜基质和系膜细胞增生,上皮和内皮细胞增生,毛细血管袢银耳环征,电子显微镜可发现上皮下和系膜区出现免疫复合物沉积。免疫荧光镜检查发现IgM、IgG、C3在系膜区和系膜毛细血管分布,符合狼疮肾炎分类标准中的Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型改变[2,3]。Pristane诱导C57BL/10鼠肾损害较轻,为系膜增殖型（Ⅱ型）[4]。

关节炎 可见于Pristane诱导后大多数BALB/c鼠,表现为滑膜细胞增生,关节边缘侵袭破坏[3,5]。人类SLE的关节炎为非侵袭破坏性,虽然少部分可出现关节侵袭破坏,但被认为是重叠综合征（SLE和类风湿关节炎重叠）,因此Pristane诱导关节炎类似类风湿关节炎。

血管炎 见于全部C57BL/10鼠,为肺脏病理见局灶出血,毛细血管炎伴有血管周围巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞侵润,电镜下见肺泡上皮损伤,但没有发现免疫复合物沉积[4]。

异位淋巴组织 腹腔注射Pristane后广泛腹膜、脾脏、肝脏出现脂肪肉芽肿（Lipogranuloma）,病理检查见单核吞噬细胞吞噬Pristane油滴,T、B淋巴细胞增殖聚集[3,4,6]。

自身抗体 血中丙种球蛋白增高,为多克隆性,并出现多种自身抗体,包括抗dsDNA抗体、抗 ss-DNA抗体、抗 RNP/Sm抗体、抗Su抗体、抗核糖体P抗体、抗组蛋白抗体。尽管部分小鼠可诱导出抗Ⅱ型胶原抗体和类风湿因子但其滴度低,而与SLE相关的自身抗体（如抗 RNP/Sm、dsDNA、ssDNA、染色质、Su、核糖体P抗原抗体）的滴度高[1-7]。

IgM型抗体出现时间较早,在给小鼠注射Pristane后2周即可出现,至3个月6/11出现IgM型抗ss-DNA抗体,4/11出现IgM型抗组蛋白抗体;IgG型抗体出现较晚,在注射Pristane后2～3个月,5/11出现IgG型抗Su抗体,至6个月7/11出现IgG型抗RNP/Sm抗体[2]。而IgG型抗dsDNA抗体常出现更晚。注射Pristane后BALB/c鼠在6个月内没有发现抗dsDNA抗体,但至第8个月BALB/c An（IL-6+/+）鼠38%（10/26）出现抗dsDNA抗体强阳性[8]。

细胞因子 外周血IFN-α水平升高,ISGs（Type I interferon-stimulated genes）如 MX-1、IRF7、ISG15 和IP10表达上调[9,10]。

2 造模影响因素

Satoh M使用Pristane诱导BALB/cByJ、BALB.K、SJL/J、A.SW 、B10.S 、C57BL/10、C57BL/6J、B6H2k、B6CH2bm12、DBA/1、DBA/2 小鼠,发现近交系不同品系小鼠均可诱导产生SLE特异性抗体,但不同品系小鼠诱导出抗体机率和滴度有差异,抗体种类受H2连锁和非H2基因影响[7]。BALB/cByJ、DBA/1、A.SW、C57Bl/6J均可产生抗Su、抗RNP/Sm 抗体（靶抗原为主要为U1RNP）、抗dsDNA抗体、抗ssDNA抗体、抗组蛋白抗体 ,而A.SW、C57Bl/6J、SJL/J 鼠可产生抗核糖体P抗体（靶抗原为P0,P1,P2）。雌性鼠易诱导出狼疮样病变[11]。虽然Pristane诱导小鼠出现狼疮样表现不需要特殊喂养环境[7],但微生物可能为协同刺激因素,因Pristane诱导狼疮小鼠产生的IgG型自身抗体水平在屏蔽环境条件下喂养比在普通环境条件下喂养要低[3,12]。

3 Pristane诱导小鼠狼疮与人类 SLE的相关性

人类SLE临床表现多样,目前普遍采用美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准诊断。该分类标准中,符合4项或4项以上者,在除外感染、肿瘤和其它结缔组织病后,可诊断为SLE。Pristane可诱导雌性鼠出现病变包括蛋白尿、免疫复合物性肾小球肾炎、关节炎,自身抗体包括ANA、抗RNP/Sm抗体、抗dsDNA抗体,符合上述SLE诊断标准[3,13]。

自发性狼疮小鼠MRL/lpr,Fas基因发生突变,产生淋巴细胞增生基因（lpr）,淋巴组织异常增生,出现狼疮样变化,但是MRL/lpr鼠为IFN-γ及其相关ISGs表达上调,而人类SLE是Ⅰ型干扰素（IFN-I）及其相关ISGs表达上调[14-16]。（NZB×NZW）F1被认为是与人类SLE最为相似的自发性狼疮标准模型,该模型胸腺皮质萎缩,T细胞在胸腺中发育不全。病变包括蛋白尿、免疫复合物性肾小球肾炎;ANA、抗dsDNA抗体,符合美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准11条中的3条标准[3,13]。但该模型不产生针对包含RNA抗原的自身抗体,尽管给（NZB×NZW）F1注射Pristane后可诱导产生抗RNP抗体[14]。

如果考虑到人类SLE出现IFN-I水平升高,其相关ISGs表达上调,凋亡小体清除障碍[15,16],这些表现在Pristane诱导小鼠狼疮同样出现,不在其它模型出现;如果认定IFN-I异常高表达是SLE致病的重要机制,那么有理由相信Pristane诱导小鼠狼疮似乎与人类SLE更为相关[13,14]。

4 免疫病理机制

鉴于Pristane诱导小鼠狼疮与人类SLE良好的相关性,人们把它作为深入了解人类SLE发病机理的重要模型,对其病理机制进行了大量研究。通常中等长度的烃是可引起炎症和增强免疫反应的潜在佐剂[17]。BALB/c小鼠腹腔注射佐剂Pristane后,Pristane油滴被单核吞噬细胞吞噬,T、B淋巴细胞增殖聚集形成肉芽肿（异位淋巴组织）。T细胞高度活化,B细胞反应性增高,产生多种自身抗体[18]。有研究认为Pristane可通过线粒体损伤途径诱发细胞凋亡,产生的核抗原在细胞因子已发生明显改变的腹腔启动了自身免疫反应[19]。

4.1 自身抗体 存在针对核抗原的自身抗体是人类SLE的主要特征。研究表明Pristane诱导小鼠狼疮和人类 SLE类似产生自身抗体需要Toll受体（TLR）活化[20-22]。RNA相关抗原可结合TLR7而活化B细胞,活化信号经MyD88传导[23]。TLR7-/-鼠被Pristane诱导产生的抗 RNA抗体明显减少,而抗DNA抗体不受影响[21]。TLR4-/-鼠被Pristane诱导产生的抗RNA抗体、抗DNA抗体均明显减少[22]。

CD1d属非经典MHCⅠ类分子,CD1d可能在Pristane诱导狼疮过程中起免疫调节作用。给CD1d-/-BALB/cJ鼠注射Pristane可比野生型BALB/cJ鼠产生更高滴度IgG型抗dsDNA抗体、抗核糖蛋白P抗体,蛋白尿、肾炎明显加重[24]。

裸鼠BALB/cnu/nuT细胞存在缺陷,B细胞数量正常,可自发产生IgM、IgG型抗ssDNA抗体。注射Pristane后BALB/cnu/nu鼠可产生更高滴度的抗ssDNA抗体,但不产生抗U1RNP、抗Sm抗体;而BALB/cnu/+和BALB/c+/+鼠既可产生抗U1RNP、抗Sm抗体,也可多生抗ssDNA抗体[25]。TSAd-/-（T cell-specific adaptor protein）C57BL/6鼠可自发产生抗ssDNA抗体、dsDNA抗体,不能被 Pristane诱导产生抗U1RNP、抗Sm抗体[26]。Fas属于TNF受体家族,可介导凋亡。B6/lpr鼠和B6/gld鼠可自发产生抗ssDNA/染色质抗体,出现狼疮样病变,但因 lpr、gld存在使Pristane不能诱导产生IgG型抗uRNP/Sm/Su/ribosomal P抗体[27]。以上现象表明Pristane诱导自身抗体产生存在复杂的机理。

4.2 肾组织损伤 免疫复合物形成和沉积是引起SLE肾脏损害的主要机制。无论是循环中的免疫复合物沉积于肾小球或原位形成的免疫复合物两者均能激活补体,引起炎性细胞浸润、炎症介质释放、凝血因子活化,导致肾小球肾炎。抗dsDNA抗体与肾损害有关[15]。但 Pristane诱导 BALB/c、SJL/J鼠肾损害出现在抗dsDNA抗体产生之前,提示其它抗体可引起肾损伤[2,25]。

Fc受体（FcγR）参与了SLE肾炎发生。免疫复合物与FcγRⅡB结合可抑制免疫复合物介导的B细胞和树突状细胞活化[28],而与FcγR I和FcγR Ⅲ结合可活化炎症细胞（包括粒细胞、单核巨噬细胞）引起组织损伤。FcγRⅡB-/-鼠经Pristane诱导肾损伤更重[29]。

4.3 细胞因子 Ⅰ型干扰素 SLE患者血中IFN-α水平升高,相关ISGs表达上调,在SLE发病中的作用越来越受重视[15]。它的产生可由TLR活化引起。TLR3识别双链病毒RNA,TLR4识别类脂、脂多糖,它们通过TRIF信号通路触发分泌IFN-Ⅰ;而TLR 7/8识别病毒单链RNA、TLR9可识别内源性未甲基化的CpG DNA,通过MyD88信号通路触发分泌IFN-Ⅰ[20-23]。对于 Pristane诱导狼疮鼠 IFN-α产生依赖TLR7/MyD88信号通路[30],由脂肪肉芽肿（异位淋巴组织）中未成熟的Ly6Chi单核细胞产生[31],同样变化可见于Pristane诱导狼疮鼠外周血中。IFN-α可调节TLR7的表达,IFN-I受体（IFNAR2）-/-BALB/c鼠注射Pristane后B细胞TLR7表达下降[14]。

Ⅰ型干扰素在Pristane诱导狼疮鼠中影响着自身抗体的产生。给IFNAR-/-129Sv鼠和野生型129Sv鼠分别注射Pristane后,发现在野生型外周血单个核细胞中 IFN-I相关ISGs高表达,出现抗RNP、Sm、ds-DNA抗体,而在 IFNAR-/-则不出现上述抗体。IFNAR2-/-BALB/c鼠注射Pristane后,产生的IgG比野生型鼠下降,但产生的IgM型自身抗体水平升高,B细胞TLR7表达下降,不产生蛋白尿[14]。给IRF9-/-（IFN regulatory factor9）鼠注射Pristane后与野生型鼠比较产生的IgG不高,但产生的IgM型自身抗体水平更高[32]。

IFN-I在免疫复合物肾炎发病中起重要作用。Pristane诱导的IFNAR-/-129Sv鼠和野生型129Sv鼠一样肾小球可见免疫复合物沉积,包括IgG、C3沉积,但与野生型不同的是它不出现蛋白尿、肾小球系膜细胞增生等肾小球肾炎表现[10]。

IL-6在人类SLE发病中起重要作用[33]。腹腔注射Pristane后小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-6增多。IL-6参与了抗DNA抗体的产生过程,IL-6-/-鼠不产生抗DNA抗体,而抗U1RNP、抗Sm抗体的产生不受影响[8]。

5 小结

SLE发病被认为与遗传因素、环境因素有关。Pristane诱导的狼疮动物模型证明了环境因素在SLE发病中的重要性。由于该模型具有SLE特异性抗体、免疫复合物型肾炎,与人类SLE有良好的相关性,目前它已成为人们研究SLE的常用动物模型。

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[收稿2010-10-27 修回2011-01-20]

（编辑 张晓舟）

R392

A

1000-484X（2011）05-0473-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.023

王卓龙（1967年-）,男,在读博士,副主任医师,主要从事系统性红斑狼疮研究,E-mail:wzhuolong@163.com;

及指导教师:曾小峰（1962年-）,男,教授,博士生导师,主要从事系统性红斑狼疮和血管炎研究,E-mail:zengxiaofeng@medmail.com.cn。