rAV-Tumstatin病毒载体对裸鼠膀胱移植癌治疗作用的初探①

李 志 魏 巍 刘禄成 郭 航 张 明 杨 潇 黄海龙

（吉林大学第二医院泌尿外科,长春 130041）

·移植免疫学·

rAV-Tumstatin病毒载体对裸鼠膀胱移植癌治疗作用的初探①

李 志 魏 巍 刘禄成 郭 航 张 明 杨 潇 黄海龙

（吉林大学第二医院泌尿外科,长春 130041）

目的:探讨重组腺病毒携带肿瘤抑素（rAV-Tumstatin）对裸鼠膀胱移植癌的治疗效果。方法:构建裸鼠膀胱移植癌模型,随机分为治疗组和对照组,记录肿瘤重量和体积,流式细胞仪（FCM）检测肿瘤细胞周期和凋亡。结果:裸鼠膀胱移植癌模型构建成功,rAV-Tumstatin病毒载体治疗组移植性膀胱癌生长受到明显抑制,肿瘤重量和体积明显小于对照组（P＜0.01）,FCM检测治疗组肿瘤细胞G1-S期进程受阻,增殖率下降,凋亡率上升,与对照组相比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论:携带rAV-Tumstatin载体通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡,发挥对裸鼠移植性膀胱癌的治疗作用。

膀胱肿瘤;裸鼠·模型;肿瘤抑素;腺病毒载体

膀胱移行细胞癌（Transitional cell carcinomaof the bladder,BTCC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤[1]。目前膀胱癌发生发展的生物学机制尚未完全明确,对其发生率居高不下和治疗后多次复发的生物学基础尚缺乏广泛深入的研究。近年有研究指出:肿瘤抑素（Tumstatin）是一种内源性的血管生成抑制因子与细胞凋亡启动子,具有2个抗肿瘤活性区,不仅通过特异性地抑制血管内皮细胞蛋白合成导致内皮细胞凋亡,使肿瘤新生血管形成受阻,还可抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡,从而遏制肿瘤生长,有可能给肿瘤的治疗带来新的希望[2,3]。但目前尚未见到Tumstatin在BTCC研究方面的文献报道。最近我们选用基因转染技术构建了rAV-Tumstatin病毒载体,并就其生物活性对BTCC细胞株T24的影响进行检测,结果表明,rAV-Tumstatin在体外能抑制膀胱癌T24细胞株增殖并诱导其凋亡,对膀胱癌基因治疗的研究具有一定的价值[4]。为进一步探索其在体内的作用,本实验以裸鼠移植性膀胱癌为模型,观察重组腺病毒携带肿瘤抑素（rAV-Tumstatin）对肿瘤的治疗作用,为其作为抗肿瘤的基因治疗药物应用于临床膀胱癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 rAV-Tumstatin病毒载体由本实验室构建[4]。人膀胱癌细胞株T24购自中国科学院上海细胞所。BALB/c裸鼠购自中国医学科学院中国协和医科大学医学实验动物研究所。细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪均为日本日立公司产品。

1.2 方法 ①裸鼠膀胱癌移植模型建立的方法步骤按参考文献[5]所述,即苯巴比妥钠麻醉后,无菌条件下F8号导尿管通过尿道插入膀胱,用酸性液体处理膀胱造成粘膜局部损伤,向损伤部位注入经胰酶消化制成浓度为5×106ml-1的处在对数生长期的人膀胱癌细胞株T24悬液0.2ml。7天时开始成瘤,28天时对照组和治疗组肿瘤分别生长至直径1.5 cm和0.9 cm大小。②把开始成瘤的30只裸鼠随机分为治疗组（20只）和对照组（10只）,两组每隔4天分别注入rAV-Tumstatin病毒载体治疗和生理盐水对比,5次20天为一个疗程,疗程结束后处死全部裸鼠,分离出瘤体,检测肿瘤重量和体积。③采用FCM分别检测肿瘤细胞周期和凋亡率。

1.3 统计学处理 应用SPSS11.5软件进行统计学分析,肿瘤重量和体积及细胞增殖率和凋亡率以±s表示,组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 裸鼠移植癌的生长情况 30只裸鼠种植人膀胱癌细胞株T24后7天开始观察,膀胱黏膜损伤部位均有病灶形成,并经病理检查证实,瘤细胞种植成功率100%。第28天时处死裸鼠,分离出瘤体称重,同时用游标卡尺测量肿瘤大小并计算瘤体积。治疗组肿瘤重量为（1.28±0.47）克,体积为（1 097.64±283.75）mm3,空白对照组肿瘤重量为（2.17±1.58）克,体积为（2 459.38±1 649±1 374.15）mm3。治疗组肿瘤的重量和体积明显低于对照组,组间比较差异有显著性（P＜0.01）,提示rAV-Tumstatin病毒载体对肿瘤生长有良好抑制作用。

2.2 癌组织中细胞凋亡率的变化 FCM结果显示:rAV-Tumstatin病毒载体组治疗后,肿瘤细胞凋亡率为（27.5±1.4）%,而未治疗组即对照组只有（9.3±0.7）%,组间比较差异具有统计学意义（P＜0.01）,显示rAV-Tumstatin病毒载体在体内能够通过诱导细胞凋亡,延缓肿瘤生长。

2.3 肿瘤细胞周期检测 FCM检测两组裸鼠移植瘤的细胞周期结果是:治疗组G0/G1期57.82%±3.91%,S期14.08%±21.73%,G2/M期6.38%±2.04%;对照组G0/G1期 39.04%±8.35%,S期26.19%±3.27%,G2/M期7.24%±5.08%。组间不同细胞周期比较差异具有统计学意义（P＜0.01）,表明rAV-Tumstatin病毒载体具有通过调控细胞周期使细胞G1-S期进程受阻从而抑制肿瘤生长的生物活性。

3 讨论

裸鼠是严重免疫缺陷的小鼠,没有异种间移植组织的免疫排斥反应,移植后细胞成活率高,在本实验中成瘤率达到100%。在裸鼠膀胱内移植并生长的人膀胱癌细胞株T24形态与人类的膀胱移行细胞癌形态具有惊人的相似,能保持原有的组织细胞形态与特征,所以实验结果可能对临床有一定的参考价值。

肿瘤抑素（Tumstatin）是 2000年由 Maeshima等[6]从肾小球基底膜中分离出来的一种内源性血管生成抑制因子。是近年来发现的作用最强的血管生成抑制因子之一,对血管内皮细胞具有特异性的抑制作用,已在肿瘤的抗血管生成治疗中得到广泛应用。进一步的实验证明,该蛋白除具有突出的抑制血管内皮细胞增殖功能外,还具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性,故其作为肿瘤抑制基因在肿瘤治疗中的作用和地位得到进一步重视和加强[7,8]。

本文作者选择携带肿瘤抑素基因的重组腺病毒载体,观察其对模型裸鼠膀胱移植癌的治疗作用。实验结果显示:用rAV-Tumstatin病毒载体治疗的裸鼠,其肿瘤重量和体积比对照组明显降低（P＜0.01）,肿瘤细胞增殖率和凋亡率与对照组相比,差异也均有统计学意义（P＜0.01）。实验数据初步展示了Tumstatin基因对裸鼠膀胱移植癌的良好治疗效果。该基因也可能成为临床上治疗膀胱癌的一个新的选择。不过值得一提的是,动物与人基因型、表型、免疫力以及对恶变细胞监督和清除的机理与能力存在差异,而且裸鼠膀胱癌模型的建立是一个被动的成瘤过程,人膀胱癌则是在自然条件下主动形成的,再者,两种癌发生发展的微环境不同,所以本实验成绩能否真正为临床带来帮助,甚至成为膀胱癌病人的福音,无疑还需要做更多、更深入的工作。

1 Takushi U,Kazutaka H,Fumiatsu Oetal.Diagnosing the location of carcinoma in situ（CIS）of the urinary bladder using pirarubicin hydrochloride[J].Urol Int,2005;74:235-239.

2 Sudhakar A,Boosani C S.Inhibition of tumor angiogenesis by tumstatin:insights into signaling mechanisms and.implications in cancer regression[J].Pharm Res,2008;25（12）:2731-2739.

3 Eikesdal H P,Sugimoto H,Birrane Getal.Identification of am ino acids essential for the antiangiogenic activity of tumstatin and itsuse in combi-nation antitumor activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008;105（39）:15040-15045.

4 任 明,刘禄成,魏 巍etal.rAV-Tumstatin病毒载体构建及其生物活性检测[J].吉林大学学报（医学版）,2010;36（3）:453-456.

5 朱德淳,梁 新,刘禄成etal.荷瘤裸鼠膀胱癌原位模型的建立及VEGF siRNA转染对肿瘤生长的影响[J].吉林大学学报（医学版）,2007;33（5）:860-862.

6 Maeshima Y,Colorado PC,Torre Aetal.Distinct antitumor propertiesof a typeⅣcollagen domain derived from basement membrane[J].Biol Chem,2000;75（28）:21340-21348.

7 Meng J,Ma N,Yan Zetal.NCR enhanced the anti-angiogenicactivity of tumstatin[J].JBiochem,2006;140（2）:299-302.

8 Lou YQ,Wang LH,Ma X Letal.Construction expression and characteri-zation of a new targeted bifunctional fusion:tumstatin15-132-TNF[J].IUBMB Life,2006;58（11）:647-652.

[收稿2010-08-16 修回2011-01-20]

（编辑 倪 鹏）

The cure effect of rAV-Tumstatin viral vector on bladder tansplanted tumor in nude m ice

LIZhi,WEIWei,LIULu-Cheng,GUOHang,ZHANGMing,YANGXiao,HUANGHai-Long.DepartmentofUrology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To investigate the cureeffectof recombinantadenoviruswhich carried with rAV-Tumstatin onb ladder transplanted tumor in nudem ice.Methods:Transplanted tumormodelof bladder canceron nudemicewas setup,and been divided into treated group and controlgroup random ly.Tumormass and volum were recorded.Tumor cell cycle and apoptosisweremeasured by FCM.Results:Transplanted tumormodel of bladder canceron nudem icewas setup successfu lly.Thegrowthof transplanted tumor among rAV-Tumstatin virusvector treated groupweremarkly suppressed.The tumormass and volumewere significantly smaller than control group（P＜0.01）.It showed cell cyclearrest on G1-Sphase in treated group,growth ratewere reduced and apoptotic indexwere increased.Therewere statisticly significance comparedwith control group（P＜0.01）.Conclusion:Vector carried with rAV-Tumstatin cou ld suppress tomor cell proliferation and induced its apoptosis.So ithad cure effecton transplanted bladder tumor.

Bladder cancer;Nudem ice·model;Tumstatin;Adenovirus vector

R373.14

A

1000-484X（2011）05-0438-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.013

①本文为国家自然科学基金资助项目（30972981）

李 志（1962年-）,男,医学学士,副教授,主要从事泌尿系肿瘤的治疗研究。

·免疫学技术与方法·