波依定对压力负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞凋亡相关基因c-myc表达的影响

侯宇 张曼 王文刚

波依定对压力负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞凋亡相关基因c-myc表达的影响

侯宇 张曼 王文刚

目的探讨波依定(非洛平缓释片)对升主动脉缩窄压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞凋亡相关基因c-myc表达的影响。方法将升主动脉缩窄术后心肌肥厚Wistar雌性大鼠随机分为2组，心肌肥厚组，给予生理盐水，1次/d灌胃(n=10);治疗组，给予波依定，1次/d灌胃(n=10);治疗4周。同时制备模型设置假手术组作为对照(n=10)，不予处置。观察各组大鼠各项指标变化。结果心肌肥厚鼠心肌细胞c-myc蛋白表达显著增高，波依定药物治疗4周后，心肌细胞内c-myc蛋白表达降低。结论心肌细胞内c-myc蛋白表达与心肌肥厚密切相关，波依定可降低肥厚心肌内c-myc蛋白表达，缓解心肌肥厚症状。

心肌肥厚;波依定;细胞凋亡

慢性心力衰竭(CHF)的特征是心功能进行性下降，其机制目前仍不完全清楚，越来越多观点认为在代偿性肥厚的心脏心肌细胞不断丢失，并被胶原纤维替代，由于收缩单元不断减少，使心功能不断下降［1］。本研究观察波依定(非洛平缓释片)对升主动脉缩窄压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞凋亡相关基因c-myc表达的影响，探讨波依定这种钙离子拮抗剂防治心肌肥厚发生、发展的作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康纯种雌性Wistar大鼠(100～150)g，30只(由中国医科大学实验动物中心提供);主要试剂:c-myc一抗(武汉博士德生物公司提供)。

1.2 建立大鼠升主动脉缩窄术模型及假手术组对照:按包伟珂等［2］法建立大鼠升主动脉缩窄术模型，纯种雌性Wistar大鼠，体重100～150 g。将升主动脉缩窄术后12周，心肌肥厚雌性Wistar大鼠随机分为2组，心肌肥厚组(生理盐水，1次/d，灌胃4 周)、波依定治疗组(10 mg/kg，1 次/d，灌胃 4周)，每组10只大鼠。假手术组:纯种雌性Wistar大鼠10只，体重100～150 g，在升主动脉相同部位套环但不结扎血管，余同上，术后观察24周。

1.3 血液动力学指标测定 术后观察期满，10%氯化钾(2 mmol/L，1 ml/只)处死大鼠后，测体重，取出心脏，去除心房、大血管及心脏外结缔组织，冲洗干净，滤纸吸干后称量左室重量，计算左室肥厚指数左室重量/体重。

1.4 免疫组化法检测心肌组织c-myc蛋白水平表达 取石蜡标本相应部位的连续切片4张，采用免疫组化ABC显色法显色，DAB棕色反应显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阳性对照。阳性结果判断:胞浆或胞膜呈棕黄色为阳性表达。参照Simler等标准进行染色强度分级［3］:(-):胞浆及胞膜无明显染色，放大倍数为40×10时仍难辨认;(+):浅着色，胞浆及胞膜内部分浅棕色，放大倍数为40×10时可辨认，但着色弱，放大倍数为10×10时难辨认;(++):中度着色，胞浆及胞膜内均浅棕色，放大倍数为10×10时可辨认;(+++):强着色，胞浆及胞膜内均深棕色，放大倍数为10×10时能清楚辨认。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5软件包里进行统计分析，所有数据采用均数±标准差(±s)表示，组内比较采用t检验，组间比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 各组大鼠(除假手术组外)均未出现明显呼吸困难、水肿、进食困难、尿少等心力衰竭症状。心肌肥厚组因严重感染症状死亡一只，其余组未见大鼠死亡。

表1 左室重量、体重结果(±s)

表1 左室重量、体重结果(±s)

注:①与假手术组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;②与心肌肥厚组比较△P＜0.05，△△P＜0.01;体重组间对比，q=0，P＞0.05;左室重量组间对比，q=273.41、273.41、140.85，P ＜0.01

N(只) 体重(g) 左室重量(mg)10 238.10±16.60 727.8±4.64心肌肥厚组 9 238.56±5.08 1245.00±14.62＊＊波依定治疗组 10 238.00±2.98 903.00±21.71假手术组＊＊△△

2.2 左室重量、体重及左室重量/体重(左室肥厚指数) 心肌肥厚组大鼠左室肥厚指数较假手术组明显增加。与心肌肥厚组相比，波依定治疗组左室肥厚指数下降(见表1)。

图1 假手术组心肌组织c-myc表达(免疫组化法) 图2 心肌肥厚组心肌组织c-myc表达(免疫组化法)图3 治疗组心肌组织c-myc表达(免疫组化法)

2.3 免疫组化法检测心肌组织c-myc蛋白水平表达:应用免疫组化法检测心肌组织c-myc蛋白水平表达，心肌肥厚组大鼠心肌细胞内c-myc蛋白表达呈(+++)，波依定治疗组大鼠心肌细胞内c-myc蛋白表达呈(+～++)，假手术组大鼠心肌细胞内c-myc蛋白表达呈(-～+)(见图1、2、3)。

3 讨论

细胞凋亡是由细胞内的凋亡相关基因直接控制，多种细胞内、外诱导因素可通过调控凋亡相关基因的表达，构成信号转导通路，启动细胞凋亡进程。凋亡是缺血和非缺血性心肌病心肌细胞死亡的形式之一，在心力衰竭的发生、发展过程中起着重要的作用［4］。凋亡相关基因包括死亡受体和死亡受体配体基因家族(如Fas和FasL等)、Bcl-2基因家族(如Bcl-2、Bcl-XL及Bax等)，P53及ICE、c-myc基因家族等，根据基因表达产物对细胞凋亡过程的影响，可将其分为促进凋亡基因(如Fas、FasL和 Bax、c-myc等)和抑制凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-XL等)。c-myc在有足够生长因子时，促进细胞增殖分裂，抑制凋亡。在没有足够生长因子时，抑制细胞增殖分裂，诱导凋亡。

本研究结果显示，心肌肥厚大鼠c-myc水平明显增加，提示c-myc蛋白水平增加参与心肌肥厚大鼠心肌细胞凋亡亢进的信号传递。应用波依定治疗可降低c-myc表达，且与左室重量结果改变相符，这可能是其改善心肌肥厚的主要机制。提示波依定对促进凋亡基因c-myc表达的作用可能是波依定抗凋亡作用的重要机制之一。

通过本实验研究使我们对波依定这种钙拮抗剂作用有了更深层次的理解。波依定抗心肌肥厚作用机制主要在于其可有效改善心肌肥厚大鼠心功能，调节凋亡相关基因cmyc表达。波依定影响心肌细胞凋亡调控基因表达的机制尚不清楚。心肌肥厚以后细胞钙稳态紊乱表现为胞浆内钙浓度不可控制地增高，钙内流和聚集被认为是死亡的共同途径。波依定可有效地降低心肌细胞内钙离子浓度，改善细胞内钙稳态紊乱所致的细胞损伤，可能是其抑制肥厚心肌细胞凋亡的重要机制。

［1］Bing OH.Hypothesis:apoptosismay be amechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload.JMol Cell Cardiol，1995，27(2):847-851.

［2］包伟珂，柏树令，王军.升主动脉缩窄心衰鼠模型制作及临床意义.中国临床解剖学，1999，17(1):366-367.

［3］Li Z，Bing OH，Long X，et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat.Am JPhysiol，1997，272(5):2313-2319.

［4］Sam F，Sawyer DB，Chang D L，etal.Progressive left ventricular remodling and apoptosis late after myocardial infarction in mouse heart.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2000，279(1):422-428.

［5］徐瑞，张运，张梅，等.SHR心肌细胞内钙离子浓度改变与左室肥厚和功能的关系.中国病理生理杂志，2003，19(5):642-644.

Effects of Plendil on the expression of c-m yc of cardiacm yocyte of cardiom yopathy m odel of pressure o- verload rats

HOU Yu，ZHANGMan，WANGWen-gang．Departmentof Cardiology，Affiliated Fengtian Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China

ObjectiveTo study the effects of Plendil on the expression of c-myc of cardiacmyocyte of cardiomyopathy pressure overload ratmodels subsequent to coarctation of ascending aorta.MethodsAmodel of cardiomyopathy induced by coarctation of ascending aorta was used in this study.20 femaleWistar cardiomyopathy rats were divided randomly into two groups(n=10).The control group

saline butfer(once a day).The treatment group received Plendil(once a day).Treatment time was 4 weeks.Ratio of LV weight to body weight，expression of c-myc were investigated in the two groups and sham operation group.Resultsc-myc expression was higher in cardiomyopathy when compared with control.Plendil could decrease the expression of c-myc level.ConclusionThese result indicated that cardiomyopathy was probably related to activating of cmyc.Plendilmay contribute to the observed beneficial effects on cardiomyopathy by the decrease of c-myc expression.

cardiomyopathy;Plendil;Cell apoptosis

110024 沈阳医学院奉天医院循环内科

张曼 沈阳医学院附属奉天医院循环内科