p－ERK1/2－AP－1通路在姜黄素抗大鼠糖尿病神经病理性痛中的作用*

黄葱葱， 陈 果， 吴 艳， 连庆泉， 李 军， 曹 红

(温州医学院附属第二医院麻醉科，温州医学院疼痛医学研究所，浙江温州325027)

糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常见的慢性并发症之一，至今尚缺乏有效的治疗方法。目前越来越多研究提示MAPK家族及某些转录因子参与了DNP的发生与持续化过程［1］。姜黄素(curcumin，Cur)是从姜黄中提取的酚性色素，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等广泛药理作用，我们的前期研究发现，在慢性结扎损伤模型(chronic constriction injury，CCI)大鼠模型中姜黄素具有神经保护作用［2］，且对MAPK通路及活化蛋白－1(activator protein－1，AP－1)等转录因子的激活具有抑制作用［3］，但其在DNP中的作用尚缺乏研究，因此本研究旨在探讨姜黄素对DNP大鼠的痛阈影响及p－ERK1/2－AP－1通路在其中的作用。

材料和方法

1 试剂与仪器

链唑霉素 (S0130，批号B64922)及Cur(28260，批号 1386823)购自 Sigma。抗 p－ERK1/2抗体(4376，兔单抗)购自Cell Signaling Technology。AP－1探针寡核苷酸序列5'－CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA－3'－生物素标记购自上海生工生物工程有限公司。2390型Electronic von Fery触觉测痛仪及II T336型甩尾足底测试仪为IITC产品。

2 动物造模及分组

清洁级雄性SD大鼠96只，体重220－250 g，由温州医学院实验动物中心提供。饲养于20－25℃、昼夜交替环境中，自由摄食摄水，实验前适应环境72 h。参照文献［4］方法制备DNP大鼠模型，除正常对照组外，其余各组在禁食不禁饮12－16 h后腹腔注射链唑霉素(streptozocin，STZ)75 mg/kg。注射STZ后3 d尾静脉非空腹血糖浓度＞16.7 mmol/L时为1型糖尿病，14 d后痛阈降低幅度＞基础值15%者为DNP造模成功［5］。将大鼠随机分为4组(n=24):正常对照组(control组)、DNP 组、DNP+溶剂(solvent，Sol)组(DNP+Sol组)、DNP+Cur 100 mg/kg组(DNP+Cur组)。DNP+Sol组、DNP+Cur组分别腹腔注射溶剂玉米油或姜黄素，按4 mL/kg，1次/d，持续2周。给药后3、7、14 d测定机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)、热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)及尾静脉非空腹血糖值，随即取出大鼠脊髓腰膨大及L4/L5背根神经节。

3 行为学测定

给药后3、7、14 d测定MWT和TWL的变化。

3.1 机械缩足阈值 置大鼠于透明的有机玻璃箱中，底为1 cm×1 cm的铁丝网，实验前使之适应15 min。手持电子压力传感器(探头为直径0.5 mm的刚性探针)由下向上垂直刺激大鼠后肢足底中部皮肤，匀速而缓慢地增加力度，直致大鼠出现快速缩足、舔足、甩尾等反应为阳性反应，记录此时电子显示器上的数值，单位为g，每次间隔30 s，左右两后肢足底交替测试，每侧3次，第1次数值波动大，故只取后5次的平均值。

3.2 热缩足潜伏期 将大鼠置于底为3 mm厚玻璃板的有机玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)中，使其适应15 min后用卤素投光灯照射大鼠后肢足底中部皮肤。热辐射刺激仪参数设定:加热头空闲时激光发射强度为20%;加热头测试工作时激光发射强度为60%;切断时间25 s以防测试时间过长对动物造成损伤;触发温度30℃。记录从照射开始至大鼠出现抬腿回避时间即为TWL，每次间隔5 min，左右两侧交替进行，每侧3次，第1次数值波动大，故只取后5次的平均值。

4 免疫组织化学染色

大鼠分别于药物干预后3、7、14 d在4%水合氯醛40 mg/kg麻醉下，经主动脉灌注生理盐水150mL，继而灌注4%多聚甲醛250 mL，取大鼠L4/L5脊髓、背根神经节，石蜡包埋，切片(4 mm)。60℃烤片至石蜡溶解，二甲苯梯度乙醇脱蜡。抗原高压热修复，3%过氧化氢封闭，滴加1∶100 p－ERK1/2的Ⅰ抗，4℃孵育24 h，取出后室温复温20－30 min，加Ⅱ抗37℃孵育30 min后PBS冲洗，DAB显色，苏木素轻度复染3 min，盐酸化酒精酸化5 s，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察。细胞核中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。采用Nikon E－800型显微照相系统采集图像。每隔5张切片取1张，计数脊髓背角I、Ⅱ层Lissauer区和背根神经节中间区p－ERK的阳性细胞率，反映其表达水平。

5 免疫印迹(Western blotting)法检测

动物在4%水合氯醛40 mg/kg深麻醉下，迅速取出L4/L5脊髓节段与L4/L5背根神经。用玻璃研磨器10倍于组织块的冰冷裂解液将组织机械性地捣碎成匀浆。提取总蛋白并根据BCA法测定样本蛋白浓度后备用。取等量样本加至10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，浓缩胶70 V，分离胶140 V。湿转法将蛋白转移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯)。5%脱脂牛奶封闭1 h后加兔抗pERK1/2多克隆抗体(1∶1 000)4℃ 孵育过夜;TBST冲洗，3×15 min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)，室温摇床孵育1.5 h，用PBS洗涤后进行增强化学荧光(enhanced chemiluminescence，ECL)反应，后显影、定影。X光图片采用Quantity One图像处理系统进行蛋白半定量分析。

6 电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)

动物在4%水合氯醛40 mg/kg深麻醉下，迅速取出L4/L5脊髓节段与L4/L5背根神经节，新鲜提取胞核蛋白备用。制备非变性6% 聚丙烯酰胺凝胶，并在0.5×TBE、100 V电压下预电泳30－60 min。寡核苷酸探针与核蛋白结合反应在20μL反应体系中，依次加入2 μL 10×结合缓冲液(10 mmol/L Tris，500 mmol/L KC1，10 mmol/L DTT，pH7.5)和 1 μL Poly(dI·dC)(1 g/L)，1 μL 5%glycerol，1 μL 1 mmol/L MgCl2，1μL 1%nonidet P － 40、1 μL 0.5 mmol/L EDTA，10 μg核蛋白及 2 μL 双链 AP －1 寡核苷酸探针(20 fmo1)，加超纯水至20 μL，混匀后，室温下反应30 min。在上述反应体系中加入上样缓冲液后在0.5×TBE环境中100 V恒压下电泳，至溴酚蓝移动到凝胶2/3－3/4处停止。将含有核蛋白－核苷酸探针复合物和游离探针的凝胶转移至带正电荷的尼龙膜，0.5×TBE，380 mA恒流，转膜60 min。用紫外手提式分析仪(254 nm)在尼龙膜上方大约1 cm处照射10 min，使寡核苷酸探针交联于尼龙膜上。封闭此膜，再加入链霉亲和素偶合辣根过氧化酶室温下摇动孵育15 min。后洗涤、平衡，进行增强化学荧光反应，即可显影、定影。X光图片采用Quantity One图像处理系统进行蛋白半定量分析。

7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析。

结 果

1 造模前后血糖的变化

大鼠腹腔单次STZ注射前尾静脉血糖值为(4.7±1.2)mmol/L，注射后3 d明显升高至(30.9±6.8)mmol/L(P＜0.01)，并能持续到注射后28 d［(33.3±3.4)mmol/L］，P ＜0.01。

2 行为学结果

DNP组STZ诱导后14 d，MWT值较造模前明显下降(P＜0.05)，且持续到STZ诱导后28 d(P＜0.05);TWL值较诱导前明显缩短(P＜0.05)，并持续到STZ诱导后28 d。Cur组姜黄素治疗7 d后行为学即有改善，与DNP组相比，可升高MWT和延长TWL(P＜0.05)，而DNP+Sol组与DNP组两者之间行为学指标无明显差异，见表1。

表1 各组别不同时点机械痛阈和热痛阈比较Table 1.Comparison of MTL and TWL among different groups(±s.n=24)

表1 各组别不同时点机械痛阈和热痛阈比较Table 1.Comparison of MTL and TWL among different groups(±s.n=24)

*P ＜0.05 vs pre－model;#P ＜0.05 vs post－ model;△P ＜0.05 vs DNP group.

Post－treatment 3 d 7 d 14 d MWT(g) Control 64±14 63±15△ 65±11△ 63±11△ 64±9.10 Index Group Pre－model Post－model△DNP 64±17 40±10* 39±11＊ 38±11＊ 37±12＊DNP+Sol 63±17 39±10＊ 37±11＊ 39±11＊ 37±10＊DNP+Cur 64±15 39±10＊ 42±10＊ 47±10＊#△ 56±12＊#△TWL(s) Control 11.4 ±2.3 11.9 ±7.4△ 11.8 ±2.3△ 11.5 ±2.1△ 11.8 ±3.1△DNP 12.0 ±3.0 7.4 ±2.2＊ 7.6 ±2.1＊ 7.5 ±1.6＊ 7.7 ±1.5＊DNP+Sol 12.0 ±3.3 7.5 ±2.1＊ 7.5 ±1.4＊ 7.3 ±1.9＊ 7.5 ±2.0＊DNP+Cur 12.1 ±3.1 7.7 ±2.2＊ 7.8 ±1.7＊ 8.8 ±2.2＊#△ 9.8 ±2.1＊#△

3 p－ERK1/2的免疫组化结果

与control组相比，DNP组大鼠在STZ诱导后14 d，脊髓背角及背根神经节p－ERK1/2表达明显升高(P＜0.05)，Cur治疗14 d后 p－ERK1/2在脊髓(图1)及背根神经节(图2)表达较DNP组有所下降(P＜0.05)，DNP+Sol组脊髓背角及背根神经节p－ERK1/2的表达与DNP组无显著差异。

Figure 1.p－ERK1/2 expression in dosal horn detected by immunohistochemisty.A－C:p－ERK1/2 expression after 14 d treatment with curcumin(Cur);A:control;B:DNP;C:DNP+Cur.△P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs DNP group.图1 免疫组化法检测脊髓背角p－ERK1/2表达

Figure 2.p－ERK1/2 expression in dorsal root ganglion after treatment with curcumin.A －C:p－ERK1/2 expression after 14 d treatment;A:control;B:DNP;C:DNP+Cur.△P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs DNP group.图2 给药后背根神经节p－ERK1/2表达

4 p－ERK1/2的Western blotting结果

与正常组比较，STZ诱导后14 d脊髓背角及背根神经节p－ERK1/2表达上调(P＜0.05)，可持续至STZ诱导后28 d(P＜0.05)。给予100 mg/kg Cur腹腔注射14 d后，与DNP组比较可明显降低p－ERK1/2的表达(P ＜0.05)，见图 3、4;DNP+Sol组脊髓背角及背根神经节p－ERK1/2的表达与DNP组无显著差异。

5 AP－1的EMSA结果

与control组比较，STZ诱导后28 d脊髓背角AP－1表达上调(P ＜0.05)，给予100mg/kg Cur腹腔注射14 d后，可明显降低脊髓背角AP－1的表达(P＜0.05)，见图5，但对背根神经节无影响(P ＞0.05)，DNP+Sol组脊髓背角AP－1表达与DNP组无差异。

Figure 3.p－ERK1/2 expression in dorsal horn detected by Western blotting.A:p － ERK1/2 expression 14 d after treatment;B:p－ERK1/2 expression at different time points after treatment.△P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs DNP group.图3 Western blotting检测脊髓背角p－ERK1/2表达

Figure 4.p－ERK1/2 expression in dorsal root ganglion detected by Western blotting.A:p － ERK1/2 expression 14 d after tratment;B:p－ERK1/2 expression at different time points after treatment.△P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs DNP group.图4 Western blotting检测背根神经节p－ERK1/2表达

Figure 5.Expression of AP－1 in dorsal horn after 14－day Cur treatment by EMSA.*P ＜0.05 vs 1 group;△P ＜0.05 vs 2 group.1:control;2:DNP;3:DNP+Cur;4:DNP+Sol.图5 Cur治疗14 d后脊髓背角AP－1的表达

讨 论

本研究发现Cur治疗14 d后可改善糖尿病神经痛大鼠痛觉过敏的行为学表现，与其抑制糖尿病诱导的p－ERK1/2及AP－1激活呈现一致性。

STZ诱导的糖尿病动物模型，由于其稳定性及重复性好、方法简单、成功率高而被广泛用于制备糖尿病动物模型。临床研究发现，DNP随年龄增加和病程延长而恶化，且与血糖控制水平密切相关［6］;但也发现一些血糖控制良好的患者其疼痛仍能持续数年，且部分患者其疼痛发作与血糖波动无一致性［7］，认为高糖血症或代谢异常所致的高血糖是DNP神经病变的一个触发因素，是必要但不充分条件，其它下游分子机制如MAPK的激活可能参与了糖尿病神经痛的形成［1，8］。在周围神经损伤的模型中可以观察到脊髓ERK磷酸化而激活，并参与了痛觉过敏形成［9］。而 Purves等［10］研究发现在 STZ 诱导的糖尿病模型中腰段背根神经节出现ERK的激活。MAPK抑制剂U0126逆转了DNP动物模型下接着所致的痛觉过敏则进一步证实了MAPK在疼痛中的关键作用［5］。糖尿病导致元醇通路激活，促进了 DRG中MAPKs的激活［11］，MAPK的激活促使转录因子如核因子 κB(nuclear factor－ κB，NF － κB)、AP －1、p53等活化转移入核进而改变某些蛋白相关基因的表达，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、环氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX －2)、内皮素1(endothelin 1 ，ET－1)、黏附分子等表达增加，加重了炎症反应，对DNP的形成和持续至关重要。而ERK的激活还能通过非转录途径如磷酸化相关蛋白、关键受体、离子通道来提高神经元兴奋性，产生痛觉过敏［12，13］。本研究结果表明，正常大鼠脊髓背角和背根神经节中神经元细胞核p－ERK1/2和AP－1表达极少，STZ诱导后14 d大鼠背根神经节和脊髓背角p－ERK1/2表达开始上调，21 d脊髓p－ERK1/2高表达，28 d脊髓AP－1表达升高，此时大鼠的痛觉过敏，痛觉异常表现最为显著，提示p－ERK1/2及AP－1的激活与痛觉过敏呈现相同的趋势，提示激活的p－ERK1/2和AP－1可能参与了DNP的发生、发展与持续化的过程。

Cur具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、改善缺血再灌注损伤等药理作用［14，15］。Cur能通过抑制 TNF－α、NO的表达而缓解糖尿病大鼠热痛觉过敏［16］。Cur能下调TGF－β1来抑制大鼠系膜细胞AP－1的活化［17］。Bierhaus等［18］证实 Cur能直接抑制 AP －1与其相应的DNA序列结合而发挥抑制作用。

Cur治疗14 d后可明显下调糖尿病神经痛大鼠脊髓背角及背根神经节中p－ERK1/2和脊髓AP－1的表达。其潜在机制可能是Cur在DNP发生的早期抑制了ERK1/2磷酸化，在DNP的后期则抑制AP－1的激活及其下游的级联反应，如各种炎症因子的表达。

本研究结果提示Cur可对抗糖尿病神经病理性疼痛，抑制了ERK与AP－1的激活，但由于缺乏特异性的ERK拮抗剂，因此我们不能确定Cur对AP－1的抑制作用是通过ERK通路亦或是直接作用于AP－1。同时在应用Cur后，糖尿病大鼠神经痛的行为学改善早于生化指标p－ERK1/2及AP－1表达的改变，提示Cur抗糖尿病大鼠神经痛还可能存在其它途径。

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