缺氧后处理中CYP2J3/EETs系统对心肌凋亡的影响*

赵艳芝， 张冬梅， 于刚刚， 曾翔俊， 王红霞， 芦玲巧， 张立克， 王岩梅△

(1首都医科大学燕京医学院生理与病理生理教研室，北京101300;2首都医科大学基础医学院病理生理教研室，北京100069)

随着抗缺血/再灌注损伤(ischemic/reperfusion，I/R)心肌自身保护研究的不断深入，近年来提出了缺血后处理(ischemic postconditioning，IPo)的概念［1］。大量研究证实缺血后处理具有缩小心肌梗死范围［2］、减轻内皮功能损伤、抗再灌注心律失常、改善心肌代谢及收缩和舒张功能、减轻超微结构的破坏等心肌保护作用［3］，减轻细胞凋亡［4］。缺血后处理对心脏再灌注的干预发生在缺血后，比缺血预处理(ischemic preconditioning，IPc)有明显的临床应用优势，故后处理越来越受到医学界的广泛关注。但后处理通过怎样的机制减轻缺血/再灌注损伤?通过哪种细胞信号转导方式发挥保护作用?尚不明了。通过在体及离体实验我室前期工作已证明缺血后处理与细胞色素P450表氧化酶2J3/环氧二十碳三烯酸系统(cytochrome P450 2J3/epoxyeicosatrienoic acids，CYP2J3/EETs)上调密切相关［2，5］。鉴于 11，12 －EET具有抑制内皮细胞凋亡作用［6］，IPo是否通过上调CYP2J3/EETs系统，进而抑制心肌细胞凋亡而保护心肌?值得探讨。本工作通过观察干预内源性CYP2J3/EETs系统对缺氧后处理(hypoxia postconditioning，HPost)心肌细胞凋亡蛋白的影响，了解缺氧后处理上调CYP2J3/EETs系统后发挥心脏保护的可能作用途径。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 胰蛋白酶(Hyclone)、胶原酶Ⅰ、Ⅱ(Sigma)、丝裂霉素 C(Roche)、DMEM(Hyclone);环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)纯品及空白对照(Sigma)、无水乙腈(Fisher Scientifid)、甲酸(Sigma－Aldrich Chemic GmbH，Riedstr)、N，N －diisopropylethy lamine(Sigam)、固相提取柱(Waster Corporation);caspase－3活性检测试剂盒(Roche)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天试剂公司)、caspase－3抗体(Santa Cruz)、Western blotting发光试剂盒(Pierce);DMSO(Sigma);细胞色素P450表氧化酶抑制剂6－(2－炔丙基氧苯基)己酸［6－(2－propargyloxyphenyl)hexanoic acid，PPOH］(Sigma);pcDNA3.12－CYP2J3质粒由本实验室构建。

1.2 主要仪器 超速低温离心机(Sigma)、细胞培养箱(Revco)、酶标仪(Labsystems)、低温冰箱(Sanyo)。

1.3 动物 Wistar乳鼠(12－24 h)由首都医科大学动物部提供。

2 方法

2.1 心肌细胞原代培养及缺氧/复氧(H/R)模型复制 取Wistar乳鼠(12－24 h)心脏做原代心肌细胞培养［7］。碘酒及乙醇消毒乳鼠胸腹部，开胸取其心脏的心室部分放入含PBS的烧杯内冲洗2次，洗净血液后剪碎心脏成1 mm×1 mm ×1 mm，各加5 mL 1.25 g/L胰酶、1 g/L胶原酶Ⅰ、0.5 g/L胶原酶Ⅱ，37℃水浴消化(加转子)4 min，首次消化液去掉，后5次消化液收集，按1∶1混合20%小牛血清的DMEM完全培养基(含青－链霉素100 mg/L)终止消化。用80目筛网过滤1次，配平后1 000 r/min离心10 min弃去上清，加完全培养基至24 mL，吹打均匀，放入1个培养瓶中，加入丝裂霉素C(2 kg/L)抑制成纤维细胞增殖，20 min、37℃培养，差速贴壁去掉成纤维细胞。免疫组化方法α－action染色鉴定心肌细胞。

将细胞放入自制的缺氧罐内，通入混合气体(O22%，CO25%，N293%)3 h后再将细胞取出，放入37℃、5%CO2培养箱中复氧2 h。

2.2 实验分组 (1)对照组(control):细胞用含20%小牛血清的DMEM培养基培养72 h，不经任何处理，继续培养5 h;(2)缺氧/复氧组(H/R):按上述方法进行缺氧复氧处理;(3)缺氧后处理组(HPost):心肌细胞缺氧3 h后，采用缺氧罐内5 min、复氧5 min重复3次的方法进行后处理，再继续复氧85 min;(4)空质粒组:按照 2 μg pcDNA3.12 质粒/1×105个细胞进行脂质体转染，转染24 h后处理同HPost组;(5)CYP2J3 转染组:按照 2 μg pcDNA3.12－CYP2J3质粒/1×105个细胞进行脂质体转染，转染24 h后处理同HPost组;(6)DMSO溶剂组:按照3 μL DMSO/L培养液进行抑制，加入DMSO 24 h后处理同HPost组;(7)PPOH组:按照3μL PPOH/L培养液进行抑制，24 h后处理同HPost组。

3 观察指标

3.1 MTT法检测细胞活力［8］取96孔培养板中各组细胞，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)继续培养4 h，终止培养，小心弃去培养液，每孔加DMSO 150 μL，微量振荡器上震摇10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪490 nm下测定各孔吸光度值(A)。

3.2 高效液相色谱法(high－performance liquid chromatography，HPLC)检测心肌细胞培养液中11，12－EET浓度［9］对心肌组织进行处理和衍生后上机检测样品，流动相:A相0.5%甲酸水溶液，B相0.5%甲酸乙腈溶液，流速1 mL/min，层析条件:前40 min B相浓度由50%增至65%，其后80 min B相浓度由65%增至100%，最后以B相100%维持20 min。

3.3 心肌细胞caspase－3蛋白含量 提取细胞蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒说明书定量蛋白，采用Western blotting方法测定各组细胞caspase－3蛋白表达变化。

3.4 心肌细胞caspase－3蛋白活性测定 提取心肌细胞蛋白，按Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天试剂公司)说明书定量蛋白，采用caspase－3蛋白活性检测试剂盒按照说明书测定caspase－3蛋白活性。

4 统计学处理

结 果

1 原代心肌细胞培养及鉴定

原代培养的乳鼠心肌细胞在光镜下呈棱型或多角形伸展，中间较厚，逐渐形成细胞簇或细胞单层，可自然搏动，频率约为50次/min;用抗肌动蛋白αactin的单克隆抗体鉴定心肌细胞呈阳性，阳性率达95%，胞浆呈淡棕色，清晰可见心肌细胞肌丝结构，见图 1、2。

2 MTT法检测细胞活力

H/R组心肌细胞活力明显低于control组(P＜0.01)，HPost组心肌细胞活力高于 H/R组(P＜0.01)，PPOH组心肌细胞活力明显低于 HPost组(P＜0.01)，CYP2J3组心肌细胞活力明显高于HPost组(P＜0.01)。PPOH组与DMSO组之间差异显著(P＜0.05)，CYP2J3组与空质粒组之间也有显著差异(P ＜0.01)，见图3。

Figure 1.Cultured neonatal rat cardiac myocytes(×200).图1 培养的乳鼠心肌细胞

Figure 2.Identification of cultured neonatal rat cardiac myocytes with immunohistochemical staining using antibody to α－actin(×200).图2 乳鼠心肌细胞鉴定

Figure 3.The effects of CYP2J3/EETs system on livability of cardiac myocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P＜0.05 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.图3 CYP2J3/EET系统对心肌细胞活力的影响

3 大鼠心肌细胞培养液中11，12－EET浓度的变化

采用HPLC检测心肌细胞培养液中11，12－EET浓度，结果发现H/R组心肌细胞培养液中11，12－EET浓度低于对照组(P＜0.01)，HPost组心肌细胞培养液中11，12－EET浓度明显高于H/R组(P＜0.01)，PPOH抑制剂组明显低于 HPost组(P＜0.01)，CYP2J3转染组明显高于 HPost组(P＜0.01)。PPOH组与DMSO组之间有显著差异(P＜0.01)，CYP2J3组与空质粒组之间也有显著差异(P＜0.01)，见图4。

4 心肌细胞caspase－3蛋白含量的变化

H/R组心肌细胞内caspase－3蛋白的表达比对照组高(P＜0.05)，HPost组心肌细胞内caspase－3蛋白的表达明显低于H/R组(P＜0.01)，CYP2J3转染组蛋白的表达明显低于 HPost组(P＜0.01)，PPOH组蛋白的表达高于 HPost组(P＜0.01)。PPOH组于 DMSO组之间差异显著(P＜0.01)，CYP2J3组与空质粒组之间也有显著差异(P＜0.05)，见图 5。

5 心肌细胞caspase－3蛋白活性

H/R组心肌细胞内caspase－3蛋白活性比对照组高(P＜0.01)，HPost组心肌细胞内caspase－3蛋白活性明显低于H/R组(P＜0.01)，空质粒组活性明显高于HPost组(P＜0.01)，CYP2J3转染组活性明显低于空质粒组(P＜0.01)，PPOH组活性高于HPost组(P＜0.01)。PPOH组于DMSO组之间差异显著(P ＜0.01)，见图6。

Figure 4.The alterations of 11，12 － EET concentration in cardiomyocyte culture medium.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;Empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs PPOH group;○○P ＜0.01 vs CYP2J3 group.图4 心肌细胞培养液中11，12－EET浓度的变化

Figure 5.The expression of caspase－3 protein in cardiomyocytes.The caspase－3 protein levels were normalized to β － actin.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+ HPost as above;with CYP2J3:transfected CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;##P ＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲P ＜0.05 vs PPOH group;○P ＜0.05 vs CYP2J3 group.图5 心肌细胞caspase－3蛋白表达的变化

讨 论

Zhao等［1］提出缺血后处理的概念后，研究已证实缺血后处理(IPo)有着与缺血预处理相似的心脏保护作用，包括减少心肌梗死面积［2］、减少再灌注心律失常的发生等。但是缺血后处理的保护作用机制尚不清楚。近年来，内源性保护物质在缺血后处理中的作用引起关注。我室前期工作证实，CYP2J3/EETs系统上调可能是缺血后处理独特的保护机制之一［2］。

CYP2J3作为细胞色素P450表氧化酶(cytochrome P450 epoxygenase)的一个亚型，主要存在于大鼠的肝脏和心脏中。EETs是花生四烯酸经CYP450表氧化酶代谢的产物，包括5，6 －EET、8，9 － EET、11，12 － EET、14，15 － EET［10］。近年来CYP2J3/EETs系统对心血管系统的调控作用引起关注。我室前期通过在体及离体实验证明，缺血后处理增加心脏CYP2J3表达及11，12－EET水平，可能是拮抗心脏再灌注损伤的信号转导途径之一［2、5］。IPo导致的 CYP2J3/EET 系统上调参与心肌保护的机制尚不清楚。鉴于IPo抑制心肌细胞凋亡，且EETs也可抑制细胞凋亡［6］，IPo是否通过上调CYP2J3/EETs系统，进而抑制心肌细胞凋亡而保护心肌的问题值得探讨。

Figure 6.The alterations of caspase－3 activity in cardiomyocytes.Control:without any treatment;H/R:3 h hypoxia+2 h reoxygenation;HPost:3 h hypoxia+3 cycles of hypoxia(5 min)/reoxygenation(5 min);DMSO:after 24 h of DMSO treatment+HPost as above;PPOH:after 24 h of PPOH treatment+HPost as above;empty vector:transfected with empty vector 24 h later+HPost as above;CYP2J3:transfected with CYP2J3 vector 24 h later+HPost as above.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group;△△P ＜0.01 vs HPost group;▲▲P ＜0.01 vs empty vector group;○○P ＜ 0.01 vs PPOH group.图6 心肌细胞内caspase－3蛋白活性的变化

PPOH是细胞色素P450表氧化酶的特异抑制剂［11］，因为它含有的苯环基团可以和表氧化酶紧密结合，除了这个苯环以外PPOH化学结构含有末端乙炔基团，正是这个基团可以导致表氧化酶自杀式的抑制［12］，实验证明PPOH末端的乙炔基团不仅可以使细胞色素P450表氧化酶血红素基团烷化，也可以使表氧化酶的表达下降［11］。这些特点使PPOH能抑制CYP2J的表达及活性，成为CYP2J的特异抑制剂。心肌中CYP450亚型主要是2J2(CYP2J2，人心脏为主)和2J3(CYP2J3，大鼠心脏为主)。所以本实验选择PPOH作为CYP2J3的抑制剂来干预CYP2J3/EET系统。

本实验观察到H/R组心肌细胞存活率低于对照组(P＜0.01)，提示缺氧/复氧可导致心肌细胞损伤，HPost组心肌细胞存活率低于缺氧/复氧组(P＜0.01)，提示HPost组可以拮抗缺氧/复氧损伤，而对缺血心肌起保护作用，与他人实验结果一致［1，2，5］。我们对其机制进行研究，发现 H/R 组心肌细胞培养液中11，12－EET浓度比CON组下降(P＜0.01)，而缺氧后处理组11，12－EET浓度高于缺氧/复氧组(P＜0.01)，在细胞水平上证明缺氧后处理有可能通过内源性11，12－EET的上调而对心肌有保护作用，这与本室在体及离体实验结果一致［2，5］。进而我们对心肌细胞进行 CYP2J3外源基因转染，结果提示基因转染组细胞存活率高于HPost组(P＜0.01)，同时11，12 － EET浓度也高于HPost组(P＜0.01)，提示转染的 CYP2J3基因进行表达，通过分解花生四烯酸，使11，12－EET浓度增加，从而保护心肌细胞。综上所述提示缺氧后处理有可能是通过提高内源性CYP2J3的表达，进而分解花生四烯酸，提高11，12－EET浓度，从而对心肌起保护作用。

在PPOH抑制剂组心肌细胞存活率和11，12－EET浓度相比缺氧后处理组明显降低(P＜0.01)，提示心肌细胞内源性CYP2J3被抑制后，导致11，12－EET浓度下降，减弱了EET对心肌的保护作用。从反面进一步证明了缺血后处理组有可能是通过提高内源性CYP2J3的表达，进而提高11，12－EET浓度而对心肌起保护作用。

研究认为，心肌细胞凋亡是多种因素引起的心肌细胞死亡的主要机制［13］。Caspases蛋白的激活是心肌细胞凋亡的一个关键现象［14］。其中caspase－3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，也是细胞凋亡的主要效应因子和最重要的执行者［15－17］。心肌缺血/再灌注促进凋亡蛋白caspase－3激活，导致的心肌细胞凋亡可能是缺血/再灌损伤的早期病理改变［18，19］。鉴于 IPo 抑制心肌细胞凋亡［1］，且 EETs也可抑制细胞凋亡［6］，IPo是否通过上调CYP2J3/EETs系统，进而抑制心肌细胞凋亡而保护缺血/再灌心肌?本实验中H/R组caspase－3蛋白表达(P＜0.05)及活性(P＜0.01)均高于对照组，细胞存活率低于对照组(P＜0.01)，表明缺氧/复氧损伤可导致细胞凋亡，与其它实验室的实验结果一致［20］。HPost组 caspase－3蛋白表达及活性均低于H/R组(P＜0.01)，提示缺氧后处理可以拮抗缺氧/复氧损伤导致的caspase－3蛋白表达增加而抑制细胞凋亡。CYP2J3转染组caspase－3蛋白表达及活性均低于H/R组(P＜0.01)，且转染CYP2J3组心肌细胞存活率也高于H/R组(P＜0.01)，表明CYP2J3高表达可能通过降低caspase－3蛋白表达、降低caspase－3蛋白活性来抑制细胞凋亡，从而对心肌细胞起保护作用。PPOH抑制剂组caspase－3蛋白表达及活性均高于HPost(P＜0.01)，从反向进一步证明了心肌细胞内源性CYP2J3被抑制后，减弱了 CYP2J3/EET系统对caspase－3蛋白表达及活性的抑制，促进了心肌细胞的凋亡。

综上所述，缺氧后处理有可能通过上调CYP2J3/EETs系统，来降低caspase－3蛋白的表达及其活性从而抑制心肌细胞凋亡，达到心肌细胞保护作用。鉴于细胞凋亡分线粒体途径和死亡受体途径2条途径，IPo导致的CYP2J3/EET系统上调究竟通过哪条途径来抑制细胞凋亡从而发挥心肌保护作用，值得进一步探讨。

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