孕酮和孕酮受体拮抗剂米非司酮对K562白血病细胞系增殖和分化的影响*

尹雅玲， 李 鹏， 魏林郁， 白瑞樱， 王亚莉

(新乡医学院1基础医学版生理学与神经生物学教研室，2药学院，河南新乡453003)

甾体类化合物在正常细胞生长代谢中扮演着重要的角色。孕酮(progesterone，P)是维持正常妊娠和女性器官发育的重要甾体激素之一，通过分布于性靶器官上的孕酮受体(progesterone receptor，PR)来发挥作用。但近年来发现孕酮对非靶器官肿瘤细胞的增殖、分化很可能也起着调节作用［1，2］。研究发现部分白血病病人的肿瘤细胞和许多白血病细胞系如:K562、U937等都表达PR，但孕酮对白血病细胞增殖、分化的作用少有报道。本研究采用人慢性粒细胞白血病急变细胞系－K562细胞株，观察P和孕酮受体拮抗剂米非司酮(mifepristone，RU486)对K562细胞增殖、分化的影响，为探讨白血病发生发展的相关机制提供实验依据。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞系 K562细胞为人慢性粒细胞白血病急变细胞系，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。用含体积分数10% 热灭活小牛血清的RPMI－1640培养基，置37℃、用含体积分数5%CO2、饱和湿度培养，每2－3 d换1次液。

1.2 药物和试剂 P(Sigma)用无水乙醇溶解并稀释成10－2mol/L浓度，4℃ 保存。RU486(Sigma)用无水乙醇溶解并稀释成10－2mol/L－10－4mol/L梯度浓度，4℃保存。2，3－双(2－甲氧基－4－硝基－5－磺酸苯基)－5－［(苯胺)羰基］－2H－四唑氢氧化物{2，3－bis(2－methoxy－4－nitro－5－sulfophenyl)－5－［(phenylamino)carbony1］－2H －tetrazolium hydroxide，XTT}(Sigma)用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)配成 1 g/L浓度，避光4℃ 保存备用。瑞氏染料1.8 g和吉姆萨染料0.18 g加入甲醇600 mL配成瑞氏－吉姆萨混合染液。FITC标记的鼠抗人CD71单克隆抗体，购自深圳晶美生物公司。联苯胺二盐酸盐(benzidine dihydrochloride)(Sigma)用0.5%乙酸配成浓度为2 g/L，避光4℃ 保存备用。

2 方法

2.1 实验分组 实验设P(终浓度10－5mol/L)联合不同浓度 RU486(终浓度分别为 10－5mol/L、10－6mol/L和 10－7mol/L)为处理组，设 P(终浓度10－5mol/L)组和RU486(终浓度10－5mol/L)组为阳性对照组，空白对照组加入与处理组等量的无水乙醇。

2.2 液体培养实验 取指数生长期K562细胞以终浓度5×107cells/L接种于24孔板内，每孔1 mL，每组平行种3复孔。置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 d，每天计数活细胞数目(台盼蓝拒染)，实验重复3次。

2.3 XTT测定 取指数生长期K562细胞以终浓度5×107cells/L接种于96孔板，每孔80 μL，每组平行种3孔，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 d。用PBS(pH 7.4)配制浓度为1 g/L的XTT和浓度为5 mmol/L的吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)，将配制好的XTT与PMS混合，每个孔中加入20 μL上述混合溶液(使得XTT终浓度为0.2 g/L，PMS 终浓度为 25 μmol/L，37 ℃、体积分数 5%CO2培养箱中培养2 h后，用ELX－800酶标仪(Bio－Tek)以双波长450 nm和630 nm测各孔的吸光度值(A)，实验重复3次。

2.4 集落形成抑制实验 取指数生长期K562细胞以终浓度106cells/L加入到体外半固体培养体系中(含体积分数30% 小牛血清和0.9% 甲基纤维素)，每孔0.5 mL接种于24孔板，每组平行种3孔，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养8 d，置倒置显微镜下计数大于50个细胞的集落，实验重复3次。

2.5 细胞形态学观察 将处于对数生长期的K562细胞以终浓度5×107cells/L加入含体积分数10%小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 d，收集各组细胞、涂片，Wright－Giemsa染色，油镜下观察细胞形态并显微照相。

2.6 血红蛋白联苯胺染色 取指数生长期K562细胞以终浓度5×107cells/L接种于 24孔板内，每孔1 mL，每组平行种3复孔。置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 d。收集各组3个平行孔细胞1 mL，调整细胞浓度为109cells/L，于4℃、1 000 r/min离心10 min，弃上清，加1 mL联苯胺和10 μL体积分数 30% 过氧化氢混匀，置 96孔板，每孔200 μL，每组3 孔，EXL－800酶标仪(Bio－Tek)波长570 nm测定吸光度值(A)，实验重复3次。

2.7 细胞膜CD71表面标记的检测 将处于对数生长期的K562细胞以终浓度5×107cells/L加入含体积分数10% 小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养4 d，分别收集各组细胞106个，PBS洗1次，先加入体积分数0.1%人血清白蛋白封闭非特异性抗体，再加入FITC标记的鼠抗人CD71单克隆抗体，4℃避光30 min，PBS洗1次，用FACScaliber流式细胞仪(Becton－Dickinson)检测，CELLQuest软件分析结果。

2.8 孕酮对K562细胞周期的影响 将处于对数生长期的K562细胞以终浓度5×107cells/L加入含体积分数10% 小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养5 d，分别收集各组细胞106个，生理盐水洗2遍，加入 体积分数75%的冷乙醇固定 24 h，PBS洗 2遍，体积分数1%RNase酶37℃ 消化30 min，50 mg/L碘化丙啶(propidine iodide，PI)染色，FCM标准程序进行细胞周期分析。

3 统计学处理

结 果

1 P和RU486对K562细胞增殖的影响

联合10－5mol/L P 与 10－5mol/L －10－7mol/L RU486共同培养5 d，K562细胞的的生长呈不同程度抑制，并随RU486的浓度升高呈剂量依赖性，见图1。单独使用10－5mol/L P和10－5mol/L RU486连续培养5 d，K562细胞生长抑制率(GIR)分别为72.52%和 12.32%，而联合 10－5mol/L P与 10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培养5 d，K562细胞的生长抑制率(GIR)分别为63.59%、49.17%和32.24%。

Figure 1.The effect of progesterone(P)and progesterone receptor antagonist mifepristone(RU486)on the growth of K562 cells.±s.n=9.图1 P和RU486对K562细胞生长的影响

XTT实验显示单独使用10－5mol/L P可显著抑制K562细胞增殖，A值与对照组比较(P＜0.01)，而联合 10－5mol/L P 与 10－5mol/L － 10－7mol/L RU486共同培养K562细胞，A值与单独使用10－5mol/L孕酮处理组比较显著升高(P＜0.01)，并呈剂量依赖性，见图2。集落形成抑制实验同样显示10－5mol/L P与10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培养，K562细胞的集落数与单独使用10－5mol/L P处理组比较显著升高(P＜0.01)，并呈剂量依赖性，见图3。

Figure 2.The effect of P and RU486 on XTT assay in K562 cells.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs P(10－5mol/L)group.图2 P和RU486对K562细胞XTT测定的影响

Figure 3.The effect of P and RU486 on colony assay in K562 cells.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs P(10－5mol/L)group.图3 P和RU486对K562细胞集落产率的影响

2 P和RU486对K562细胞形态学的影响

K562细胞培养5 d后，Wright－Giemsa染色，光镜下可见空白对照组和单独使用10－5mol/L RU486组的K562细胞胞浆深蓝色，核大，呈圆形或椭圆形，染色质疏松细致，可见1－3个核仁，核浆比例大，见图4A、C;经10－5mol/L P处理后的细胞体积变大，核浆比例减少，有核切迹，核染色质浓集变粗，部分细胞核仁比较明显，胞质增多，浅染，核周胞质出现淡染区，表现一定程度的分化，见图4B。经10－5mol/L P分别联合 10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同处理的K562细胞显示出上述分化现象的细胞数量，同10－5mol/L P处理组比较数量减少，并随着联合应用的RU486的浓度呈现一定剂量依赖性，见图4D－F。

Figure 4.The effects of P and RU486 on morphology of K562 cells(Wright－Giemsa staining，×1 000).A:control group;B:P(10－5 mol/L)group;C:RU486(10 －5mol/L)group;D:P(10 －5mol/L)combined with RU486(10 －7mol/L)group;E:P(10 －5mol/L)combined with RU486(10 －6mol/L)group;F:10 －5mol/L P combined with RU486(10 －5mol/L)group.图4 P和RU486对K562细胞形态的影响

3 P和RU486对K562细胞内血红蛋白联苯胺染色的影响

10－5mol/L P作用5 d后，K562细胞联苯胺染色A值明显升高，与空白对照组比较(P＜0.01)。联合10－5mol/L P与10－5mol/L－1－7mol/L RU486共同培养5 d，K562细胞的联苯胺染色A值与单独使用10－5mol/L P处理组比较显著下降(P＜0.01)，并随RU486的浓度升高呈剂量依赖性。单独使用10－5mol/L RU486培养5 d，K562细胞的联苯胺染色A值与空白对照组比较无显著差异(P＞0.05)，见图5。

4 P作用下K562细胞膜CD71表面标记的表达

流式细胞仪分析显示，10－5mol/L P作用于K562细胞4 d后，85.72%的细胞膜上CD71表面标记表达阳性，说明孕酮可以诱导K562细胞向红系分化，见图6B。联合10－5mol/L P 与10－5mol/L －1－7mol/L RU486共同培养，K562细胞CD71表达阳性率与单独使用10－5mol/L P组比较显著下降(P＜0.01)，并随RU486的浓度升高呈剂量依赖性，见图6D－F。单独使用10－5mol/L RU486培养组，K562细胞CD71表达阳性率与空白对照组比较无显著差异(P ＞0.05)，见图6C。

Figure 5.The effect of P and RU486 on benzidine staining(A570 value)in K562 cells.±s.n=9.＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs P(10－5mol/L)group.图5 P和RU486对K562细胞联苯胺染色的影响

5 P对K562细胞周期的影响

流式细胞仪检测发现，分布于细胞周期G1期、S期和G2期的K562细胞数有明显不同。单独使用10－5mol/L P组分布于S期的细胞与对照组比较明显增加(P＜0.01)，而分布在G1期和 G2期的细胞数与对照组比较明显减少(P＜0.01)，可见孕酮对K562细胞的抑制作用很可能是由于将其细胞周期阻滞在S期所致，见表1。联合10－5mol/L P与10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培养，分布于S期的K562细胞与单独使用10－5mol/L P组比较有显著差异(P＜0.01)，并随RU486的浓度升高呈剂量依赖性。单独使用10－5mol/L RU486组，分布于S期的K562细胞与空白对照组比较差异无显著(P＞0.05)，见表1。

表1 P和RU486对K562细胞周期的影响Table 1.The effect of P and RU486 on the cell cycle in K562 cells(%.±s.n=3)

表1 P和RU486对K562细胞周期的影响Table 1.The effect of P and RU486 on the cell cycle in K562 cells(%.±s.n=3)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs P(10 －5mol/L)group.

Group G1－phase S－phase G2－phase Control 35.61 ±2.07 52.69 ±2.58 11.74 ±1.97 P(10－5mol/L) 18.85 ±1.43＊＊ 76.16 ±1.35＊＊ 4.99 ±1.27＊＊RU486(10 －5mol/L) 33.04 ±1.11 56.22 ±1.43 11.68 ±1.79 P(10－5mol/L)+RU486(10－7mol/L) 19.33 ±1.21＊＊ 72.74 ±2.58＊＊ 7.21 ±1.43*P(10－5mol/L)+RU486(10－6mol/L) 21.33 ±0.78＊＊## 69.74 ±1.47＊＊## 9.33 ±1.97＊＊##P(10－5mol/L)+RU486(10－5mol/L) 23.04 ±1.45＊＊## 65.83 ±1.64＊＊## 11.17 ±1.39##

讨 论

P是由卵巢的黄体颗粒细胞产生的一类甾体类激素。近年来的研究发现，甾体类激素及其衍生物不仅在正常细胞生长代谢，红细胞的氧化损伤，脏器的缺血再灌注修复和神经损伤修复过程中扮演着重要的角色，而且对肿瘤细胞的增殖、分化也起着重要的调节作用［1，2］。白血病的发生发展与细胞增殖和分化之间的平衡失调有关，表现为增殖失控而分化受阻。以往的工作也证实甾体类化合物对某些白血病细胞系确实具有生物学活性［3，4］，具有较强的诱导白血病细胞分化、抑制增殖和促进细胞凋亡的作用。传统认为，P是通过位于胞内的孕酮核受体来发挥作用。白血病细胞的研究显示，在 THP－1、U226、MOT、U937和K562等部分白血病细胞系中可检测到P核受体的表达［5］。早先的研究也发现，在用长春新碱、强的松和黄体酮联合化疗的病人比单独使用长春新碱和强的松表现出明显的缓解，尤其是P受体表达阳性的白血病病人［6］。本研究从液体培养，XTT测定、集落形成抑制实验和细胞周期观察细胞的增殖能力，从细胞形态学、联苯胺染色和分化抗原CD71表达观察孕酮和孕酮受体拮抗剂对细胞的诱导分化能力。结果显示10－5mol/L P在体外实验中可显著抑制K562细胞增殖并诱导其向红系分化，而联合P和不同浓度RU486处理K562细胞则可不同程度阻断单独使用P时对K562细胞的抑制增殖和诱导分化作用。在体外实验中进一步证实了P对K562白血病细胞的作用，提示其作用发挥很可能是通过P核受体。但最近的研究发现孕酮对白血病等肿瘤细胞的效应与P诱导的阻断因子(progesterone－ induced blocking factor，PIBF)有关［7，8］。PIBF 在正常妊娠过程中可抑制自然杀伤细胞的活性，参与免疫逃避。在大多数白血病细胞中都检测到其mRNA的表达。P及RU486可分别上调和下调PIBFmRNA及其蛋白的表达［9］。因此，RU486则有助于白血病的免疫治疗。本研究也观测了10－5mol/L RU486对K562细胞的作用，结果显示10－5mol/L RU486在体外实验中可一定程度地抑制K562增殖，但其抑制程度要比单独使用P弱，同时在体外RU486对K562细胞并无诱导分化作用。这一结果与最近的研究并不矛盾。但是这一结果也提示我们P对白血病细胞很可能不完全通过 P核受体。在 JUKAT、HL60、HUT102等白血病细胞系中虽未检测到孕酮受体表达［10］，但是P却可促进HL60在脂多糖作用下释放IL－1β。那么P对白血病细胞的增殖和分化的作用与P核受体是多大相关性?其作用的发挥是否还有其它因素参与?这将是我们下一步需要探讨的。

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