应用不对称竞争性PCR技术确定藏羊Agouti基因拷贝重复数

杨树猛 ，岳耀敬 ，杨博辉 ，郭 健，孙晓萍 ，牛春娥 ，冯瑞林 ，郭婷婷

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 730050；2.甘肃省甘南州畜牧科学研究所，合作 747000）

祁连白藏羊完整地保留了高原型藏羊的各项生产性能和体貌特征，尤以品质优良的“祁连大白毛”著称于世。白藏羊肉质鲜美，风味独特，具有良好的开发前景。截至2006年，祁连县藏羊存栏99.28万只，占海北州藏羊总数的43.3%。为了促进这一优势品种的发展，同时促进以大白毛为基础的藏地毯业发展，在农业部及各级政府部门的大力支持下，成立了祁连白藏羊选育中心，以该中心核心群为基础开展白藏羊毛色完全纯白为选育目的的白藏羊选育工作［1］。但目前白藏羊的毛色选育工作主要以常规育种手段的品种育种为主。许多研究结果和众多的实例已揭示绵羊的毛色是由多基因位点上的复等位基因控制的。迄今，经试验证明或理论推测判定的绵羊毛色基因位点共有11个［2］，因此应用常规育种技术难以选择。绵羊分子育种技术的快速发展为开展青海白藏羊毛色控制基因机制研究和毛色分子标记辅助选择提供了良好契机。

哺乳动物的毛色是由毛发中色素的多少决定，色素有真黑色素（eumelanin）与褐黑色素（pheomelanin）两种类型，两者的相对数量与分布决定了哺乳动物表现出从白至黑多种颜色［2］。关于哺乳动物毛色的发生及机理历来受到广泛关注，在研究一种被毛黑白相间的豚鼠Agouti时发现一种基因与其毛色相关，后来这种基因就被称为Agouti，随后在多种动物中发现该基因，并且具有相似调节机制。Agouti是一种旁分泌的信号因子，即Agouti信号蛋白（agouti signaling protein，ASIP），由临近于黑色素细胞的真皮乳头细胞所分泌，作用于毛囊微环境，阻止α2黑色素细胞刺激激素（α2MSH）与其受体（melanocort 2 in receptor 1，MC1R）的结合，从而拮颃黑色素的产生［2］。Norris等应用不对称竞争性PCR（asymmetric competitive PCR）研究表明，不同品种羊由于Agouti信号蛋白基因拷贝数的变异和错义突变导致了不同的毛色［3］。藏羊被毛颜色丰富，有关其毛色发生机制的研究尚属空白，Agouti基因是否为控制青海白藏羊毛色的主效基因也未见研究报道。

从分子水平确定Agouti基因的基因型有助于在育种实践中快速准确地控制藏羊的被毛类型，但第一步必须检测该基因拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。在最近的研究中，实时定量PCR、侵染检测、焦磷酸测序、寡核普酸连接分析法、不对称竞争性PCR等技术都被用来进行CNV检测［3-5］。相对于其他方法复杂、不便于一般实验室操作的缺点，不对称竞争性PCR可以直接对产物进行定量，操作简单、安全，自动化程度高，不易产生污染［3，5］。本研究拟选取Agouti基因为研究对象，以藏羊血液基因组为材料，扩增藏羊Agouti基因序列，采用不对称竞争性PCR技术测定藏羊Agouti基因的拷贝重复数，有望能够建立一种更加有效的检测方法，开展不同毛色藏羊Agouti基因拷贝数目变异与毛色之间的关系研究，为进一步开展Agouti基因多态性与藏羊毛色的早期分子标记辅助选择研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 16只不同毛色藏羊血样均采自青海省祁连县白藏羊选育中心，颈静脉采血10 mL，EDTA抗凝，－20℃冷冻保存备用，同时进行毛色拍照登记。

图1 不同毛色藏羊

1.2 试剂与仪器 2×Taq PCR Master Mix、血液基因组DNA提取试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司；BigDye®Teminator V3.1 Cycle Sequencing Kit购于ABI公司，主要包括BigDye®Teminator V3.1 Cycle Sequencing RR-100和Big-Dye®Teminator V3.1 Cycle 10×Sequencing Buffer；Hi-Di Formamide（去离子甲酰胺）购于ABI公司；其他常规药品均为国产分析纯。石蜡油购自北京鼎国生物技术有限责任公司。ABI3130xl全自动测序仪为美国应用生物系统公司产品；VeritiTM 96-Well Thermal Cycler型PCR仪为美国 ABI公司产品；Allegra TM 21R离心机为美国Beckman公司产品；荧光定量PCR仪CFX96为美国Bio-Rad公司产品；Nano Drop ND-2000核酸定量仪为美国Nanodrop公司产品。引物合成及测序由上海生工生物技术开发有限公司完成。

1.3 引物的设计与合成 从GenBank数据库中下载绵羊Agouti基因全序列（GenBank accession No.EU216425），用Primer 5.0设计目的基因的不对称竞争性PCR［3］。引物 序 列 （5'-3'） 分 别 为 ：Agt16：FamCAGCAATGAGGACGTGAGTTT；Agt17：GTTTCTGCTGGACCTCTTGTTC；Agt18：gtgCCTTGTGAGGTAGAGATGGTGTT。引物 Agt17和Agt16对用于扩增Agouti基因5'断裂点（5'breakpoint）238 bp片段，引物 Agt18和 Agt16对用于扩增Agouti基因连接点（junction point）242 bp 片段，引物由上海生工生物工程公司合成。

图2 Agouti基因引物Agt17、Agt18、Agt16扩增示意图

1.4 不对称竞争性PCR 不对称竞争性PCR扩增体系：①Agouti基因：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16 引物 Forward Primer（1 μM）0.5 μL，Agt17引物Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt 18 引物（10 μM）1.0 μL，模板 DNA 4 μL，双蒸水 ddH2O 3.5 μL，总计 20 μL。为确保实验的可靠性，所有参与实验的样品、对照均进行3次重复。

PCR 条件：95 ℃ 5min，95 ℃ 1min，60.0 ℃ 30s，72 ℃60 s，共50个循环；72℃延伸10 min。

按照ABI3130xl全自动测序仪说明书要求，制备测序样品，并对PCR产物进行测序检测Agouti基因拷贝数。依据检测结果，Agouti基因拷贝数即Agouti基因连接点的比值为Agouti基因连接点（junction point）242 bp片段峰面积与Agouti基因连接点（junction point）242 bp片段峰面积加Agouti基因5'断裂点（5'breakpoint）238 bp片段峰面积的比值=A242/（A242+A238）。

1.5 待测样品Agouti基因拷贝数的标准曲线建立 依据Norris等（2008）建立Agouti基因拷贝数的标准曲线的方法建立藏羊Agouti基因拷贝数的标准曲线：①Agouti基因连接点标准品PCR产物制备：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16 引物 Forward Primer（10 μM）1.0 μL，Agt17 引物 Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt18引物（10 μM）1.0 μL，模板 DNA 4 μL，双蒸水 ddH2O 3.5 μL，总计 20 μL。②Agouti基因 5'断裂点标准品 PCR产物制备：2×TaqMan Genotyping Master Mix 10 μL，Agt16引物 Forward Primer（10 μM）1.0 μL，Agt18 引物 Reverse Primer（10 μM）1 μL，Agt18 引物（10 μM）1.0 μL，模板DNA 4 μL，双蒸水 ddH2O 3.5 μL，总计 20 μL。③将步骤①、②PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收238 bp、242 bp片段，将回收各样品的两个PCR片段用T4连接酶连接构建 pMD19－junction point、pMD19－5'break point载体，转化大肠杆菌（Escherichia.coli）感受态细胞JM109。蓝白斑筛选阳性克隆，小量抽提质粒后质粒测序鉴定。经测序鉴定后确认为pMD19－junction point、pMD19－5'break point载体作为Agouti基因拷贝数的标准曲线基因检测的标准品。

用Nano Drop ND－2000核酸定量仪分别测定标准品pMD19－junction point、pMD19－5'break point载体的浓度，统一稀释为 10 ng/μL，然后将 pMD19－5'break point/pMD19－junction point载体的浓度比分别稀释为0、25%、35%、50%、65%、75%、100%后进行不对称竞争性PCR扩增，检测Agouti基因拷贝数即Agouti基因连接点的比值，绘制标准曲线。

1.6 待测样品Agouti基因拷贝数的测定 根据50个未知样品的原始DNA浓度，使用双蒸水分别将其稀释，使其浓度均达到10 ng/μL，配制成工作液待用。分别对50个未知样品（体系内终浓度分别为10 ng/μL）的Agouti基因进行不对称竞争性PCR扩增，依据标准曲线确定Agouti基因拷贝数。

2 结果与讨论

2.1 藏羊基因组DNA 图3为藏羊血样中提取的基因组DNA，经充分溶解，适当稀释后，以0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测所得的电泳图谱。结果表明，所提取基因组DNA条带清晰、明亮、无降解，质量较好。经紫外分光光度计检测，所提取基因组DNA的OD260/OD280比值约为 1.80，浓度 200～300 ng/μL，说明 DNA 纯度和浓度符合要求，可用于定量PCR实验。

图3 藏羊血样中提取的基因组DNA

2.2 Agouti基因拷贝数的不对称竞争性PCR 将不对称竞争性PCR扩增产物，按照ABI3130xl全自动测序仪说明书要求，制备测序样品，并对PCR产物进行测序检测Agouti基因拷贝数。检测结果用ABI3130xl全自动测序仪自带软件GeneMapper software－Microsatellite Analysis工作流程进行分析，共检测出两个峰（图4），分别为引物Agt17和Agt16对用于扩增Agouti基因5'断裂点（5'break point）238 bp片段峰，引物Agt18和Agt16对用于扩增Agouti基因连接点（junction point）242 bp片段峰。扩增产物测序结果与扩增的目的片段完全吻合，表明该方法具有很好的特异性。

图4 ABI3130xl全自动测序仪检测结果

2.3 Agouti基因拷贝数的标准曲线 以Agouti基因连接点的比值即A242/（A242+A238）为纵坐标，以pMD19－5'breakpoint/pMD19－junction point载体的浓度比为横坐标绘制标准曲线（图5）。由图5可知，Agouti基因连接点的比值等于 pMD19－5'break point/pMD19－junction point载体的浓度（r2＝0.999）。结果表明：pMD19－5'break point/pMD19－junction point载体的浓度比在1%～100%范围内均与所测得的相应峰面积比呈良好的线性关系，可以用该标准曲线对Agouti基因进行相对定量，检测Agouti基因拷贝数。

图5 标准品Agouti基因的标准曲线

2.4 未知样品Agouti基因的定量检测 对16只藏羊的基因拷贝数进行了不对称竞争性PCR扩增产物，记录所得Agouti基因连接点的比值。对样品（n＝16）的Agouti基因连接点的比值进行分析，区分未知样品Agouti基因的拷贝数（图6）。当Agouti基因连接点的比值为0.33时，表明只有1个Agouti基因连接点，即只含有1个拷贝的ASIP黑色隐形基因位点，当Agouti基因连接点的比值为0.5时，表明有2个Agouti基因连接点，即含有3个拷贝的ASIP基因位点。结果显示10只全白藏羊均为3～6个拷贝之间，其余不同毛色藏羊的拷贝数为2个拷贝。

图6 未知样品Agouti基因拷贝重复数的Agouti基因连接点的比值（n＝16）

3 结论

本研究建立了不对称竞争性PCR检测Agouti基因拷贝重复数变异的方法，该方法可以直接对产物进行定量，具有良好的稳定性和特异性，而且操作简单、安全，自动化程度高，不易产生污染，不需昂贵设备，适合在普通实验室检测。为开展Agouti基因多态性与藏羊毛色的早期分子标记辅助选择研究奠定基础。

［1］王永，郑玉才，梁梓，等.草地藏系绵羊羊肉品质特性研究［J］.中国草食动物，2006，26（Z1），195－198.

［2］范瑞文，董常生，赫晓燕，等.哺乳动物毛色色素Agouti基因位点的研究进展［J］.动物医学进展，2004，25（3）：59－61.

［3］Norris B J，Whan V A.A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep［J］.Genome Res，2008，18：1282－1293.

［4］Stranger B E，Forrest M S，Dunning M，et al.Relative impact of nucleotide and copy number variation on gene expression phenotypes［J］.Science，2007，315：848－853.

［5］Pielberg G，Day A E，Plastow G S，et al.A sensitive method for detecting variation in copy numbers of duplicated genes［J］.Genome Res，2003，13：2171－2177.