HPLC-ELSD测定八珍益母丸中水苏碱的含量

蒋 歆， 丁永辉， 魏学冰， 杨 锡

(1.兰州大学药学院，甘肃兰州730000;2.甘肃省食品药品监督管理局，甘肃兰州730000;3.甘肃省药品检验所，甘肃 兰州730000)

八珍益母处方源于明代张景岳《景岳全书》，并被解放后历版《中国药典》收载。处方由益母草、党参、白术(炒)、茯苓、甘草、当归、白芍(酒炒)、川芎、熟地黄组成，用于气血两虚兼有血瘀所致的月经不调、月经周期错后、行经量少、淋漓不净［1］等症。其中益母草为君药，为唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的干燥全草，水苏碱为益母草的主要成分之一，且含量较大。中国药典对益母草及益母草膏中水苏碱的含量作为指标成分采用薄层扫描法进行测定［2］，操作烦琐，误差较大。本文采用HPLC-ELSD法测定八珍益母丸中水苏碱的含量，操作简便、灵敏度高、稳定性及重现性较好，可作为八珍益母丸中水苏碱含量测定的新方法。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪;Waters 2424蒸发光散射检测器;KQ250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);德国Sartorius R200D型分析天平(十万分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(万分之一);盐酸水苏碱对照品(购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号:110712-200508);八珍益母丸(批号为 090310、090311、090312)，乙腈(色谱纯，DIKMA公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件［3］

色谱柱:Venusil HILIC 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20);流速:0.5 mL/min;柱温:35℃，ELSD检测器:载气(N2)气体流速:流速2.8 L/min，飘移管温度105℃，雾化室温度:80℃，增益值为135，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取在105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱12.68 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含0.253 6 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取八珍益母丸研细，称取1 g，置于50 mL三角瓶中，加乙醚30 mL，回流0.5 h，弃去乙醚液，残渣加乙醇30 mL回流提取30 min，过滤，残渣及滤器用10 mL乙醇冲洗，滤液置水浴上浓缩约至干，残渣用乙醇溶解并定容至5 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

根据样品处方，制备不含益母草的阴性样品，照供试品溶液的制备项同法操作，即可。

2.5 方法的专属性考察

在上述色谱条件下，水苏碱峰与其他成分分离良好，阴性对照样品试验，结果表明提取物中其它成分对水苏碱的测定无干扰，结果见图1，以水苏碱峰计算色谱柱的理论板数为8 200。

2.6 线性关系的考察

取对照品溶液 4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0、30.0 μL分别进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的对数值为纵坐标，盐酸水苏碱对照品(0.253 6 mg/mL)进样量的对数值为横坐标(μg)，进行线性回归，得回归方程为:lgA=4.729 2+1.005 6lgC，r=0.999 3(n=8)，线性范围为1.014 4 ～7.608 0 μg。

图1 八珍益母丸HPLC-ELSD

2.7 精密度试验

2.7.1 日内精密度

取盐酸水苏碱对照品溶液，连续进样5次，每次进样10 μL，对峰面积进行考察，RSD为1.52%。

2.7.2 日间精密度

取对照品溶液10 μL进样，每天进样两针，考查3天。测得盐酸水苏碱峰面积RSD为1.84%，说明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批号的八珍益母丸(批号:090304)，平行取样6份，按2.3项方法操作并检测。结果盐酸水苏碱平均含量为0.398 8(mg/g)，RSD为1.96%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取0.253 6 mg/mL盐酸水苏碱对照品溶液及供试品溶液，于 0、1、2、4、8、12 h 按上述色谱条件分别进样 20 μL，按盐酸水苏碱峰面积计算RSD值分别为0.2%、1.8%，表明对照品溶液和供试品溶液均在12 h内稳定。

2.10 回收率试验

采用加样回收法，分别精密称取已测知含量(批号090304，0.398 8 mg/g)的样品，按2.3项法操作并检测。各进样20 μL，记录色谱图，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.11 样品测定

取3批供试品，同2.3项供试品溶液的制备处理 ，制成供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液20 μL，对照品溶液5 μL及20 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以外标两点法对数方程计算样品中水苏碱的含量，结果见表2。

表2 样品的测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测方法的选择 取盐酸水苏碱对照品溶液进行紫外光谱扫描，结果在201 nm波长处有最大吸收，已低于甲醇等常用流动相的截止波长，不宜用紫外检测器对其进行检测，而用通用型蒸发光散射检测器(ELSD)［4-5］进行检测可得到较好的分离。

3.2 样品的提取 八珍益母丸提取物组分复杂，根据水苏碱不溶于乙醚、氯仿的特性，样品提取时加乙醚30 mL，回流半小时，弃去乙醚液，除去醚溶性成分，残渣加乙醇30 mL回流提取30 min，过滤，置水浴上浓缩至干，乙醇定容至5 mL，使样品得到较好的富集和净化。

3.3 流动相的选择 采用不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等多种溶剂系统作为流动相，结果以乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20)作为流动相，色谱图峰型好，出峰时间适宜，分离效果较好。

3.4 试验中考查不同漂移管温度、雾化室温度和气体流速对测量结果的影响，结果表明在漂移管温度105℃，雾化室温度80℃，载气体积流量2.8 L/min时测量的灵敏度较高，且稳定性较好，故本试验采用此条件作为测量条件。

3.5 色谱柱选择［6-7］由于盐酸水苏碱极性较大，使用传统的反相色谱流动相通常在死时间流出而无法得到分离，而亲水性色谱柱(HILIC)能为强极性的化合物提供合适的保留，所以本实验选择稳定性好的亲水性丙基酰胺键合硅胶(Venusil-HILIC，100Å，4.6 mm ×250 mm，5 μm，VH952505-0)对水苏碱进行分离，取得了较好的分离效果。

［1］阮金兰，杜俊蓉，曾庆忠.益母草的化学、药理和临床研究进展［J］.中草药，2003，11(11):15.

［2］中国药典［S］.一部.2005:312-313.

［3］严优芍，李卫民.HPLC法测定益母草不同制剂中水苏碱［J］.中草药，2006，37(1)，70-72.

［4］冯 旭，成 智，梁臣艳.HPLC-ELSD测定益母颗粒中盐酸水苏碱的含量［J］.中成药，2008，3(1):2-3.

［5］张彦青，解军波，张明春，等.HPLC-ELSD法测定酸枣仁滴丸中酸枣仁皂苷A、B和白桦脂酸［J］.中草药，2009，40(2):234-235.

［6］林冬杰，张会球.HPLC-ELSD法测定益母草流浸膏中盐酸水苏碱的含量［J］.亚太传统医药，2009，5(2):45-46.

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