人乳头瘤病毒16 E6蛋白与人端粒酶逆转录酶在乳腺癌中的表达及意义

李 博，黄 河，赵 瑛

山西医科大学第一医院普外科，山西太原 030001

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，但目前有关乳腺癌发生的确切病因及机制仍未阐明，已知的高危因素只能解释一部分的病例。人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）特别是高危HPV16病毒是一种肿瘤相关病毒，但其与乳腺癌发病的相关性研究结果在不同报道的差异较大。近年来，研究显示端粒酶的结构和行为异常被认为与肿瘤发生、发展密切相关。本研究采用随机对照实验来探讨HPV16 E6蛋白及人端粒酶逆转录酶蛋白（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）与乳腺癌发生的相关性，并初步探讨其机制，为乳腺癌发生、发展的研究提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

随机抽取山西医科大学第一附属医院2008年1月～2010年8月经手术切除术后病理证实的女性乳腺癌组织材料40例及正常乳腺组织20例。年龄32～70岁，平均53.2岁。其中1例为浸润性导管癌合并Paget病，其余均为浸润性导管癌。

1.2 试剂与方法

HPV16 E6 （bs-0990R） 兔抗人抗体及 hTERT（bs-1411R）兔抗人抗体购自北京博奥森生物技术公司，S-P试剂盒（兔PV-6001）购自北京中杉金桥生物技术公司。

HPV16 E6及hTERT一抗稀释度均为 1∶200，HPV16 E6需作EDTA高压抗原修复，hTERT需作枸橼酸盐高压抗原修复，按S-P试剂盒操作步骤染色，用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断标准

HPV16 E6和hTERT以细胞核呈棕黄色着色为阳性表达。计数≥500个肿瘤细胞，以细胞核内出现棕黄色颗粒且阳性细胞数≥10%为（+），＜10%为（-）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行 χ2检验和Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16 E6及hTERT在乳腺组织中的表达

HPV16 E6及hTERT阳性棕黄色颗粒在乳腺癌组织中定位于癌细胞核内，正常乳腺组织中定位于导管上皮细胞核内，灶状或弥漫分布，肌上皮细胞核及间质内无阳性着色，背景清晰。见图1～4。

2.2 HPV16 E6及hTERT在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达

在40例乳腺癌组织中，有22例HPV16 E6蛋白表达呈阳性，有23例hTERT蛋白表达呈阳性。在20例正常乳腺组织中，有2例HPV16 E6蛋白表达呈阳性，1例hTERT蛋白表达呈阳性。乳腺癌组与正常乳腺组织组HPV16 E6蛋白阳性表达情况比较，差异有统计学意义（χ2=12.80＞3.84，P＜0.05）。乳腺癌组与正常组hTERT蛋白阳性表达情况比较，差异有统计学意义（χ2=16.20＞3.84，P＜0.05）。 见表1、2。

表1 乳腺癌及正常乳腺组织中人乳头瘤病毒16 E6蛋白的表达情况（例）

表2 乳腺癌及正常乳腺组织中人端粒酶逆转录酶蛋白的表达情况（例）

2.3 HPV16 E6与hTERT在乳腺癌中的相关性分析

在22例HPV16 E6蛋白表达阳性的乳腺癌组织中，有16例hTERT蛋白表达呈阳性。根据相关性分析，HPV16 E6与hTERT在乳腺癌中的表达呈显著性相关（r=0.341，P＜0.05）。见表3。

表3 乳腺癌中人乳头瘤病毒16 E6蛋白与人端粒酶逆转录酶蛋白表达情况

3 讨论

1990年Band等[1]应用HPV16基因在体外诱导出乳腺导管上皮细胞永生化后，从此开始了人们对HPV在乳腺癌作为促癌因子或致癌因子方面及其发病机制的研究。本研究的结果显示，部分癌组织和正常乳腺组织中均有HPV16感染的存在，而且乳腺癌组织中HPV16 E6的阳性表达显著高于正常乳腺组织，表明HPV16型的感染可能与乳腺癌的发生密切相关。Wang等[2]进行的HPV16的E6转基因鼠的研究，证实了携带有HPV16 E6基因的小鼠能够发生乳腺部位的肿瘤。国内研究报道[3]指出HPV16 E6和E7基因共存于部分乳腺癌组织中，HPV16可能是乳腺癌发病的病因学因素之一。

乳腺癌组中hTERT的阳性表达显著高于正常组，表明hTERT可能与女性乳腺癌的发生密切相关。虽然人类肿瘤细胞中广泛存在较高的端粒酶活性，甚至在一些肿瘤中端粒酶活性高低与恶性程度一致，但端粒酶自身并没有能力引起肿瘤[4]。要维持肿瘤的发生、发展及恶性转化，就需要更高的端粒酶水平来更有效地维持端粒的长度，这往往要求端粒酶的重新激活。端粒酶在乳腺癌细胞的发生、发展中起到一定的作用，可以将端粒酶作为一种新的肿瘤标记，通过对细胞端粒酶的检测来协助乳腺癌的诊断[5]。

在22例表达HPV16 E6蛋白的乳腺癌中，有16例表达hTERT蛋白，且根据相关性分析证明在乳腺癌中二者表达具有相关性，表明在乳腺癌中HPV16 E6可能通过某种途径再激活了hTERT，从而导致了乳腺癌的发生。Veldman等[6]研究发现，E6癌蛋白在人角化上皮细胞中能使hTERT启动子的活性增加6.5倍，而此作用主要与hTERT上的251bp（-211～ +40）片段有关，其中的 35bp（5～40）片段与60%的E6癌蛋白有关。目前有研究表明[7]，高危型HPV E6蛋白的转化功能是通过E6与E6AP的相互作用，降解肿瘤抑制因子p53。HPV E6的C端介导了与PDZ蛋白的直接结合。C末段序列的缺失会抑制E6介导的小鼠细胞恶性转化和鼠模型系统中上皮细胞过度增生，说明E6与PDZ结合在HPV相关性致癌作用中起重要作用。最后，HPV E6通过改变hTERT的表达，提高端粒酶的活性，通过延长染色体末端延长细胞的生存周期[8]。说明E6是高危型HPV的一个重要的致癌基因，其编码的E6蛋白不具有内在酶活性，但它可通过直接或间接与各种靶蛋白相互作用，如通过抑制P53和PDZ蛋白家族的活性从而增强端粒酶活性致癌。Klingelhutz等[9]用HPV16 E6蛋白作用于早期人角质细胞和哺乳类上皮细胞，发现E6蛋白可以激活端粒酶，并且E6蛋白激活端粒酶是p53非依赖性。从而可以知道，HPV感染是启动因子，通过各种途径导致端粒酶重新激活，使细胞获得无限增殖能力。

从目前的研究来看，HPV转染细胞成为永生化细胞要经历2个阶段：第一阶段细胞生命期延长，细胞持续增殖，端粒长度进行性缩短；第二阶段细胞永生化阶段，细胞激活端粒维持机制，获得无限增殖的潜能。在乳腺癌的病毒癌发生机制中，HPV病毒再激活端粒酶的具体途径还有待进一步探讨。

[1]Band V,Zajchowski D,Kulesa V.Human papilloma virus DNAs immortalize normal human mammary epithelial cells and reduce their growth factor requirements[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990,87：463-467.

[2]Wang HDY,Chae KR,Shin DH,et al.Mammary gland tumor in Transgenic mice expressing targeted betaease in/HPV16 E6 fusion gene[J].Int Oneol,2000,17(6)：1093-1098.

[3]何谦,张淑群,楚雍烈,等.乳腺癌组织中HPV16 E6和E7的检测[J].现代检验医学杂志,2008,(1)：20.

[4]Jiang XR,Jimenez G,Chang E,et al.Telomerase expression in human somatic cells does not induce changes associated with a transformed phenotype[J].Nature Genet,1999,21(1)：111-114.

[5]吴建农,刘敏,孙亚军,等.乳腺癌端粒酶的表达及其与肿块大小浸润和转移的关系[J].现代医药卫生,2007,23(6)：797-798.

[6]Veldman T,Holikawa I,Barrett JC,et al.Transcriptional activation of the telomerase Htert gene by human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein[J].J Virol,2001,75(9)：4467-5572.

[7]James MA,Lee JH,Klingelhutz AJ.Human papillomavirus type 16 E6 activates NF2 kappa B,induces clAP22 expression,and protects against apoptosis in a PDZ binding motif 2 dependent manner[J].J Virol,2006,80(11)：5301-5307.

[8]赵思成,骆丹.HPV E6蛋白及其在致癌过程中作用的靶蛋白[J].中国生物化学与分子生物学报,2009,25(3)：225-228.

[9]Klingelhutz AJ,Foster SA.McDougall JK.Telomerase activation by the E6 gene product of human papillomavirus type 16[J].Nature,1996,380(6)：79-82.