环磷酰胺复制中老年男性雄激素部分缺乏综合征大鼠模型的研究

何清湖，周 兴

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院男性病科，湖南 长沙 410007）

环磷酰胺复制中老年男性雄激素部分缺乏综合征大鼠模型的研究

何清湖1，周 兴2

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院男性病科，湖南 长沙 410007）

目的 应用环磷酰胺复制中老年男性雄激素部分缺乏综合征的大鼠模型建立。方法 取20只大鼠随机分为2组：正常组，模型组。分别于造模前、造模后1 d、造模后30 d观察大鼠一般情况、体质量、悬尾实验和强迫游泳实验时间以及睾丸指数，放射免疫法测定各组造模前后血清TT、FT水平，免疫组化法测定各组大鼠睾丸间质细胞stAR蛋白平均灰度值，并进行统计分析。结果 与正常组比较，模型组大鼠悬尾实验时间延长，差异具有统计学意义（P＜0.01），强迫游泳实验时间缩短，差异具有统计学意义（P＜0.01），血清TT、FT水平、stAR蛋白平均灰度值均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 环磷酰胺造成的大鼠血清TT、FT水平下降，行为学改变的反睾丸组织退行性变，基本类似PADAM模型。

中老年男性雄激素部分缺乏综合征；环磷酰胺；动物模型；大鼠

中老年男性雄激素部分缺乏综合征（partial androgen deficiency of aging male，PADAM）， 是指中老年男性随着年龄的增长体内雄激素合成功能逐步衰退，出现以生殖生理和植物神经系统功能紊乱为主的症候群，主要表现为性欲减低、勃起障碍、疲乏、精力不集中、甚至抑郁、焦虑、烦躁易怒等一系列临床综合征，严重地影响了患者的健康与工作。有关该病病因及发病机制的探索、治疗方法的评价和新药的研发在很大程度上需要通过动物实验进行，因此PADAM动物模型的研制显得尤为重要。本文试图以环磷酰胺造成大鼠生殖系统受损、雄激素部分缺乏，从而复制出PADAM大鼠模型，为PADAM的深入研究提供一个新的途径。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠，6月龄，体质量（200±20）g，20只。由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（湘）-2006-0002。

1.1.2 药物 环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，0.2 g/瓶，批准文号：国药准字 H32020857。

1.1.3 仪器 石蜡切片机、光学显微镜、微量电子天平等均由湖南中医药大学病理教研室提供。

1.1.4 试剂 血清总睾酮（TT）放射免疫试剂盒，批号：E0458r；游离睾酮（FT）放射免疫试剂盒，批号：E0457r；类固醇合成快速调节蛋白（stAR蛋白）免疫组化试剂盒，批号：M6691m-h；均由武汉中美科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按随机原则，分为2组并编号：正常组（10 只），模型组（10 只）。

1.2.2 造模 参考章振宝[1-2]、张培海[3]等的造模方法。模型组予腹腔注射环磷酰胺，20 mg/（kg·d），正常组予腹腔注射与模型组等体积的生理盐水，连续5 d。

1.2.3 一般情况观察 包括大鼠毛色，精神状态，活动情况、体质量等；睾丸及睾丸指数。

睾丸指数=双侧睾丸质量（g）/体质量（g）×100%

1.2.4 大鼠悬尾实验 本实验于环磷酰胺造模前1天、造模后第1天、第30天进行。将大鼠尾端2 cm的部位固定在同一水平木板上 (木板离地1 m左右)，使动物呈倒挂状。悬挂两侧用板隔开动物视线，动物为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”，显示“失望”状态。计算6 min内的不动时间，并同时观察大鼠挣扎幅度及抑郁状态。此实验能一定程度地反映动物的肌力及抑郁程度。

1.2.5 大鼠强迫游泳实验 本实验在实验结束当天进行。以实验室洗手池作为游泳池，规格为100 cm×60 cm×85 cm，游泳时水深为60 cm，大鼠不能以尾撑池底休息，水温(25±1)℃。将大鼠置入游泳池，分别记录大鼠从入水到游泳至力竭的时间。本实验参照Mcardle[4]推荐的力竭判断标准，即游泳最后下沉，经10 s后仍不能返回水面为力竭。常温下游泳至力竭的时间是反映动物体力及衡量动物是否疲劳的经典指标。

1.2.6 睾丸组织形态学观察 采用HE染色，光镜下观察睾丸组织形态。

1.2.7 血清TT、FT 采用放射免疫法。

1.2.8 stAR蛋白阳性率 采用免疫组化法。

1.2.9 形态计量分析 利用MIAS-300型图像分析系统，分别测定免疫组化染色阳性反应物的灰度值以反应各组标本产物的相对含量，每例随机选样10个高倍视野，约100个细胞的平均灰度值，则反映该例平均灰度值，它是用来表示图像透光率的参数，与免疫组化阳性表达成反比。若细胞内阳性反应产物浓度越高，透光率低，则灰度值越低，反之则越大。

1.3 统计学分析

所有数据以SPSS 14.0统计软件包处理，采用t检验，用“”表示，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对两组大鼠一般情况的影响

正常组：大鼠一般情况良好，运动活泼有力，反应敏捷，眼睛明亮有神，食欲健旺，鼠毛柔顺浓密，洁净有光泽，肌肉发达，脂肪丰满，体质量均匀增长。模型组：大鼠一般情况较差，萎靡倦卧少动，甚者蜷缩至垫料下面，眼睛暗淡少神，进食减少，鼠毛枯干蓬乱萎黄，污浊无光泽，体质量无明显增长。

2.2 对两组大鼠体质量及睾丸指数的影响

造模前，两组大鼠体质量比较，无统计学意义（P＞0.1），具有可比性。 造模后 1、30 d，两组大鼠体质量比较均有统计学意义（P＜0.01），提示环磷酰胺能减轻大鼠体质量。与正常组比较，睾丸指数显著降低（P＜0.01）。 结果见表 1。

表1 对两组大鼠体质量及睾丸指数的影响（，g，n=10）

表1 对两组大鼠体质量及睾丸指数的影响（，g，n=10）

注：与正常组比较▲P＜0.01。下表同。

组 别正常组模型组造模前210.32±14.896 209.63±17.341造模后1 d 225.4±17.765 212.5±20.430▲造模后30 d 281.8±11.234 180.0±3.553▲睾丸指数1.66±0.117 1.17±0.115▲

2.3 对两组大鼠行为学改变的影响

两组大鼠造模前悬尾时间无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。造模后1 d、30 d，悬尾时间和游泳时间分别与正常组比较，均存在显著差异（P＜0.01）。结果见表2。

表2 两组大鼠悬尾实验及强迫游泳实验时间比较 （，n=10）

表2 两组大鼠悬尾实验及强迫游泳实验时间比较 （，n=10）

组 别正常组模型组悬尾实验（s）造模前 造模后1 d 造模后30 d 171.25±17.389 169.62±16.625 164.81±6.509 172.77±15.213 186.86±23.469▲ 191.69±10.929▲强迫游泳实验(min)28.04±6.071 20.07±9.765▲

2.4 对两组大鼠血清TT、FT水平，stAR蛋白平均灰度值的影响

两组大鼠造模前TT、FT水平无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。造模后第1天、第30天，TT、FT水平分别与正常组比较，均差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组stAR蛋白平均灰度值比较，明显高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果见表3、4，见图 1。

表3 两组大鼠血清TT水平比较 （，ng/dL，n=10）

表3 两组大鼠血清TT水平比较 （，ng/dL，n=10）

组 别正常组模型组造模前183.453±32.343 184.997±28.550造模后1 d 185.253±30.453 59.834±18.242▲造模后30 d 190.430±24.629 59.930±20.523▲

表4 两组大鼠血清FT水平及stAR蛋白平均灰度值比较 （，ng/dL，n=10）

表4 两组大鼠血清FT水平及stAR蛋白平均灰度值比较 （，ng/dL，n=10）

组 别正常组模型组造模前3.562±1.275 3.633±0.986造模后1 d 3.750±1.038 1.601±0.753▲造模后30 d 3.881±0.994 1.420±0.651▲stAR蛋白平均灰度值0.146±0.053 0.266±0.109▲

图1 两组大鼠睾丸组织形态学光镜图（HE染色×400）及stAR蛋白免疫组化（×400）

3 讨论

目前用于PADAM研究的动物模型较少，主要是采用自然老化的更年期大鼠模型。一般用20～24月龄的大鼠，该模型与PADAM的生物学特性较为接近，然而出于经济利益的考虑，大多数实验动物中心不太可能将雄性大鼠白白饲养两年后再出售，因此这种自然老化的更年期大鼠来源非常稀少。那么，如何复制出一种方便、可行、经济、实用的PADAM动物模型显得尤为重要。

郭应禄[5]等认为PADAM的发生与发展，包含有众多的激素水平改变、许多相关的疾病、精神心理、环境及其他因素的影响，但雄激素（睾酮）的部分缺乏是PADAM的最重要原因之一。因此以睾酮作为检验本模型的关键性指标。睾酮的合成是以胆固醇为原料，在睾丸间质细胞进行（约占95%），在这一过程中，胆固醇进入线粒体内膜 (由StAR蛋白完成)、胆固醇裂解为孕烯醇酮(由P450scc催化)、孕烯醇酮变成孕酮(由3β-HSD催化)，这3个反应构成了睾酮合成的限速步骤[6-8]。

大量研究证实，环磷酸胺具有生殖毒性。主要表现在：睾丸损伤[9]、生精功能障碍[10-12]、染色体畸变[13]、睾酮合成障碍[14]等。本实验以环磷酰胺生殖毒性为基础，依据章振保[1-2]、张培海[3]等的造模方法，应用环磷酰胺造模后，与正常组比较，模型组大鼠出现了体质量减轻，活动减少，毛发卷曲发黄干枯无光泽，血清TT、FT（血清TT水平不完全能够反映生物活性睾酮的水平，所以实验中同时增加了对FT水平的检测）水平下降（P<0.01），行为学（悬尾试验和强迫游泳实验）部分改变，睾丸系数显著降低以及睾丸组织HE染色（见图A1、A2）示睾丸曲精小管直径缩小、间距增宽、生精上皮变薄、结缔组织增生、生精细胞和间质细胞数目减少等退行性变化，基本类似PADAM，说明应用环磷酰胺复制PADAM动物模型是可行的。

Ujjal B.D[15]等推测，其机制可能与环磷酰胺显著抑制睾丸间质细胞内 3β-HSD、17β-HSD的活性，引起睾酮合成障碍，血清T水平下降有关。本实验研究显示，模型组stAR蛋白平均灰度值（见图B1、B2）明显升高，因此环磷酰胺降低血清T水平可能还与影响stAR活性有关。它是否通过调节下丘脑-垂体-睾丸生殖轴或其他的途径，仍有待进一步研究。本研究的模型动物仍有低水平的T分泌，这与自然造模法以及临床实际相接近，且与自然造模法相比更为经济实用。但本模型也有一些不足之处，如临床常见的烘热汗出、心悸失眠、忧郁健忘、头晕、腰酸等症状在动物身上较难观察，这些症状大多与自主神经功能紊乱、中枢神经递质的变化有关。

[1]章振保，杨庆涛，杨镜秋，等.淫羊藿苷、菟丝子提取物对雄激素部分缺乏大鼠生殖保护作用的比较研究 [J].中国老年学杂志，2006，26（10）：1 389-1 391.

[2]章振保，杨庆涛.淫羊藿甙抗大鼠雄激素部分缺乏的实验研究[J].中国男科学杂志，2006，20（3）：47-50.

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（本文编辑 彭芝配）

Study of partial and rogen deficiency model induced by cyclophosphamide in rats

HE Qing-hu,ZHOU Xing
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To reproduce the partial and rogen deficiency model using cyclophosphamide （CP） in rats.Methods 20 ratswere divided randomly into normal control group(N)and model group(M).Before modeling and after modeling 1 day and 30 days,all the rats were measured their general situation and weight,observed in tail suspension experiment and exhaustion swimming test and their testicular index,and evaluated their status,serum TT and FT level were detected with radiation immune measuring,and leydig cell stAR with immunohistochemical.Result Compared with N,the tail suspension test time in M was longer（P＜0.01） and exhaustion swimming time shorter（P＜0.01）;the serum TT and FT level and expression level of leydig cell stAR protein decreased(P＜0.05).Conclusion The serum TT and FT level to decline rats by CP is similar to clinical PADAM.

partial androgen deficiency of aging male（PADAM）;cyclophosphamide（CP）;animal model;rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.004.015.03

2010－07－07

国家自然科学基金项目（30973759/H2709）；湖南省自然科学基金项目（09JJ3054）。

何清湖（1965-），男，湖南耒阳人，教授，医学博士，博士研究生导师，主要从事中西医结合男性病、生殖亚健康研究。

book=168,ebook=168